宏基因组最热应用领域介绍 | 微生物专题
大家好，这里是微生物专题系列的第二篇——宏基因组应用场景。上一期我们梳理了宏基因组的背景知识，从宏基因组是什么、怎么做和做什么三个方面简单介绍了近年来宏基因组的发展。今天的推文，就来看看宏基因组中的热点应用吧。
2014年新英格兰医学杂志报道了一个通过宏基因组辅助检测治愈的案例 [1]，这也是历史上首个宏基因组临床应用成功的案例，一时激起热议。文章报道了一位原因不明、4个月内经历三次反复发热并伴有头疼、癫痫及脑积水症状的14岁男孩，开始的常规治疗及病原筛查都没有确诊原因。随后对脑脊液样本测序筛查，结合生物信息学分析结果及已有报道发现一种可疑的致病菌 leptospira infection（图1），随后对其针对性地使用万古霉素和头孢吡肟治疗后出院。该团队在后期验证中确认这是一种尚未报道过的病原微生物，通过 IgM 设计了对应的检测试剂盒，并通过了FDA认证。
图1 通过无偏好二代测序技术（NGS）诊断钩端螺旋体感染案例
宏基因组以无需纯化培养、能够快速全面的展示序列信息的优势，逐步在临床上开枝散叶。
2019年第29届欧洲微生物与感染病学大会（ECCMID）上，复旦大学附属中山医院的胡必杰团队参会并做 [mNGS临床研究最新进展] 报告，该研究总共收集511例样本，其中传染病347例（占比67.9％）、非传染性疾病119例（占比23.3％）、未知病例45例（占比8.8％），评估了 mNGS 与传统培养检测病原体方法之间的差异及抗生素治疗后 mNGS 的诊断性能（图2）。研究结果显示，mNGS具有更高的病原体鉴定灵敏度，受抗生素的影响较小，因此具有检测传染疾病的潜力及临床意义 [2]。
图2 样本收集、分类及分析流程图。ID：传染病；NID：非传染性疾病。
文章已发表在 Clinical Infectious diseases 杂志发表（IF-9.117），感染性疾病的诊断亟需快速、准确的检测手段改善预后，虽然 mNGS已成为一种高效的临床诊断方法，但是也存在一些待改良的地方。我们就顺着 19年3月27日发表在 Nature上的综述来梳理一下宏基因组在临床上应用吧。
微生物组指的是包括微生物（细菌、古细菌、低等或高等真核生物和病毒）的基因组（基因），以及其周围环境在内的全部，即结合了宏基因组学、代谢组学、宏转录组学、以及宏蛋白组学等和临床/环境数据的集合。临床微生物学领域主要包括诊断微生物学 (diagnostic microbiology ) 、公共卫生微生物组学、传染病爆发的监管 (surveillance and monitoring)，包括从临床样本中间鉴定病原体到指导治疗，
早在2000年， microarray 已应用于临床宏基因组，例如破译SARS冠状病毒、获得癌症 mutations 基因表达谱，以及比较不同人位置不同位置的微生物组信息。2005年后，测序技术的发展和测序成本的指数下降共同推动NGS技术的迅速普及，使分析临床或环境样本中整个遗传内容成为可能。
目前，不仅已在个人病例上应用宏基因组成功确认病原微生物，同时在细菌耐药性领域也有很大的突破。近年来的临床宏基因组报道内容详见下表：
临床样本中病原体的常规检测仅针对于培养的微生物，通过生化表型测试MALDI、生物特异性标志物抗体检测ELISA 或使用 panels 通过单一或多重PCR检测。检测能够针对大多数已知的感染物，检测时间在2小时内。
Illumina 标准流程中，宏基因组不仅能够获得更丰富的病原微生物信息（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫），同时能够通过转录组数据分析其与宿主基因间的相互作用，但也需要更长的分析时间。根据测序对象，能够将临床宏基因组分为靶向和非靶向测序（图3）。靶向测序主要指扩增子测序，包括16s rDNA、 ITS 测序及特异探针捕获测序的方法，后者获取的数据目标更明确，同时也需要更高的成本及更长的杂交时间。非靶向宏基因组通过构建测序文库除了能够获得完整的DNA信息外，还能够获得RNA信息 (反转录为cDNA)。不仅能够用于细菌亚型分析同时可以追踪细菌爆发的起源与进化。但是，mNGS 的灵敏度取决于样本背景，同时可能受到非无菌部位取样的污染干扰。尽管如此，已有多篇报道证实宏基因组在脑膜炎、败血症和肺炎病原微生物诊断上的应用前景。
除了全血或外周血单核细胞（PBMC）外，任何体液或者组织都适用于基于RNA-seq分析人类宿主基因表达情况，基于机器学习的RNA-seq数据分析已被用于癌症分类，宏转录组同样也能应用于分析获得流感、结核病、细菌败血症的宿主生物标志物。虽然目前并没有 RNA-seq的检测在临床应用，但是能够从不同的维度进行分析，比如区分感染与定植，微生物的活性等。
图3 基于二代测序的靶向与非靶向宏基因组方法流程图
微生物组从实验室走向临床仍会遇到挑战，宏基因组的每一个步骤在实施过程中，都需严格操作，避免交叉污染，以最大化准确性和临床相关性（图4）。比如样本收集过程中人类宿主背景的干扰、测序及分析的周期及成本、分析过程中阈值的设定及假阳性控制及病人数据的保护、监管政策等挑战。
图 4 临床应用宏基因组测序中的挑战
宏基因组在临床上也具有广泛的应用场景。比如目前研究发现，微生物组分的改变（或称为失调 (dusbiosis)） 与肥胖，糖尿病和炎症性肠病相关，调整菌群可能能够改善疾病。一些病毒（比如孢疹病毒、乳头瘤病毒和多瘤病毒）可能与癌症相关。通过对特异性病毒探针或外显子组测序能够获得整合的外源病毒，能够为靶向抗病毒和/或化学治疗药物的预防性和治疗性干预提供信息。未来甚至可以作为癌症筛查手段。
5月27日，英国约克大学研究团队检测了72个国家711条河流抗生素污染情况，发现65%的河流均有不同程度的抗生素污染，比如甲氧苄啶、环丙沙星等，对于超级耐药菌多见现况，人类不得不警惕对致病菌 [无药可用] 的情形。宏基因组在临床上准确诊断，将指导抗生素使用，避免滥用情况。
宏基因组将从实验室应用于临床诊断，包括抗生素耐药性研究、微生物组、人类宿主基因表达及肿瘤学研究。在未来，将提供患者治疗和公共健康的解决方案。
参考文献:
[1] Wilson, M. R., Naccache, S. N., Samayoa, E., Biagtan, M., Bashir, H., Yu, G., … Chiu, C. Y. (2014). Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing. New England Journal of Medicine, 370(25), 2408–2417. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1401268
[2] Miao, Q., Ma, Y., Wang, Q., Pan, J., Zhang, Y., Jin, W., … Hu, B. (2018). Microbiological Diagnostic Performance of Metagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice. Clinical Infectious Diseases, 67(suppl_2), S231–S240. https://doi.org/10.1093/cid/ciy693
[3] Chiu, C. Y., & Miller, S. A. (2019). Clinical metagenomics. Nature Reviews Genetics. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0113-7
https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1401268
https://academic.oup.com/cid/article-abstract/67/suppl_2/S231/5181274?redirectedFrom=fulltext
https://www.nature.com/articles/s41576-019-0113-7
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