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人类正常眼球表面的真菌特征

题目：Characterization of fungal microbiota on normal ocular surface of humans

发表期刊： Clinical Microbiology and Infection

影响因子： 6.425

发表单位： 山东省眼科研究所

技术手段：ITS测序

研究背景

研究表明，黏膜表面，如口腔、肠道、呼吸道、引道、皮肤都已经被真菌占据。越来越多的证据表明，真菌微生物群可与宿主免疫系统相互作用，发生疾病时真菌微生物群的状态也会改变。然而几乎没有人注意到也属于粘膜组织的眼表面。正常的眼表面是否像身体其他部位一样被真菌微生物占据还未可知。此外，还没有人意识到真菌在眼部真菌疾病中扮演的角色，例如真菌性角膜炎。

真菌性角膜炎是一种威胁视力的传染性角膜疾病，在中国、印度、加纳、尼泊尔等发展中国家尤为严重。最普遍的诱发因素是眼外伤。然而，有越来越多的无创伤性案例表明：真菌性角膜炎的发生也许和眼球表面的真菌微生物有关。

之前的研究使用第二代测序方法探索健康成年人正常眼球表面的细菌微生物群：山东省眼科研究所黄钰森组：人类眼结膜微生物群落新发现。 研究者观察到，与健康的眼睛相比，真菌性角膜炎患者的感染眼睛和另一只眼睛的细菌多样性都有所减少，眼表微生物成分也发生了改变。于是本文研究测定了正常眼球表面的真菌组成。

研究方法

本次实验共招收了45名成年受试者，在详细的眼部检查后，从每个受试者的眼部随机抽取两份拭子，共获得90个结膜拭子。

取样：用无菌一次性拭子从上睑结膜、下睑结膜和穹窿结膜处采集结膜拭子标本。进行标本采集时，在局部麻醉下取得两份擦拭实验拭子，及一份无任何处理的一次性无菌拭子作为空白对照，均放入不含RNase的微量离心管保存。将所有标本收集在紫外灭菌室中，其中一份样本进行测序，另一份进行常规真菌培养。用于ITS测序的结膜拭子放入无菌管中，在进行DNA提取之前储存在-80℃的冰箱中。另外用于真菌培养的结膜样本立即接种在沙氏葡萄糖琼脂上，然后在27℃下培养4周，每天进行观察。用于ITS测序的样本从结膜拭子中提取DNA，同时对照组进行相应处理。将每个拭子的总提取DNA在60µL的无菌洗脱缓冲液中进行洗脱，然后储存在-80℃的冰箱中

研究发现

研究表明，常规真菌培养方法的45个样品中分离出了四种丝状真菌，包括柑桔青霉，黑曲霉，瓶霉菌和木霉菌。 在用于测序的45个样本中，18个样本为PCR扩增阳性，并用于随后的ITS测序。测序后共生成了518,703份有效读数，并分配到467个OTUs中。 总体而言，本研究鉴定了4个门和94个属。 其中担子菌门属（78.67％）和子囊菌门属（19.54％），马拉色菌属（74.65％），红酵母属（1.93％），Davidiella属（1.89％），曲霉菌属（1.25％）和链格孢属（0.61％）占真菌微生物组的80％以上，并且在超过80％的受试者中呈现，构成了正常眼球表面上可能的“核心真菌分类群”。

(A)在属水平上，将所有序列分为94个不同的真菌属，每个个体检测到19.67±7.92(范围为6 ~ 38)个属。

(B)50%以上受测试者的真菌属出现频率。

(C)受试者中鉴定到的属的频率分布。

讨论

在以前常规真菌培养的眼球表面真菌菌群调查中，真菌的阳性率为3％~28％。本次研究显示出这个范围内的近8.9％的阳性真菌。

Ando等人的研究表明曲霉菌，红酵母菌，假丝酵母菌和青霉菌是结膜囊培养中最常见的真菌。研究确定了一个更丰富和多样化的真菌群落，包括很少报道的真菌，如马拉色菌，石油菌和单孢酿酒酵母。此外，真菌群落的组成与以前的报道不同。此次研究和以前的研究之间的真菌菌群的差异可能是由于不同的使用方法造成的。由于不同菌种对生长条件和生长速率的要求不同，培养的方法在识别所有菌种方面存在局限性。还有相当多的真菌是不可培育的。因此，传统技术无法提供全面的解决方案。相反，与培养无关的测序方法克服了这些缺点。然而，很难确定用测序方法鉴定的真菌是否确实存在于自然系统中。

在本次研究中，有一些真菌没有被分类和鉴定，表明用测序方法对真菌进行分类对数据库有很强的依赖性。核心微生物群只考虑微生物群落的持久性（或者丰富度），通过定义“核心微生物群”来简化分析和鉴别重要微生物越来越受欢迎。本次研究以80%为标准来定义是否符合“核心微生物群”。 并且选择最小相对序列丰度阈值为0.01%的以保留一些罕见的分类群，舍弃瞬态类群。因此，担子菌门和子囊菌门、马拉色菌属、红杜鹃属、曲霉属、Davidiella和链格孢属被认为是正常眼表可能的“核心真菌类群”。由于本次研究是一项“横向”研究，不能区分共生真菌和瞬态真菌。还需要进一步的调查来确定共生的或正常的眼球表面的瞬态真菌微生物群，并确定职业、季节和地理环境是否会影响眼部表面的真菌。改变眼球表面的真菌微生物可能导致发生真菌性角膜炎。先前在正常结膜微生物群中发现棒状杆菌、假单胞菌、葡萄球菌、不动杆菌和链球菌可能是“核心属”。

本次研究还发现真菌性角膜炎患者的眼睛中角膜棒状杆菌和葡萄球菌的丰度低于正常人的眼睛。患者的另一只眼睛中也观察到棒状杆菌和葡萄球菌的丰度明显降低，这表明患者对真菌的易感性更高。真菌性角膜炎患者的假单胞菌、无色杆菌、柄杆菌和嗜冷杆菌等属的相对丰度高于健康人。小鼠眼结膜上的棒状杆菌属的 mastiditis菌通过启动γδ+ T细胞依赖性IL-17反应保护它免受念珠菌性角膜炎的侵害。这表明正常的微生物群可能通过微生物 - 宿主免疫的的复杂相互作用，从而在眼睛健康中发挥保护作用。

之前报道的70多种真菌物种是角膜真菌病的常见致病病原体。本研究利用ITS测序方法鉴定出94种不同的真菌属, 包括马拉色菌属，枝顶孢属，链格孢菌属，曲霉菌属，念珠菌属，头梗霉属，金孢子菌属，枝孢菌属，隐球菌属，外小杯菌属 ，镰刀菌属，拟青霉属属，青霉菌属，红冬孢酵母属，红酵母属，玉米大斑病菌属和轮枝菌属。其中，在该研究中至少50％的受试者中观察到马拉色菌属，链格孢菌属，曲霉菌属，Candidia属，枝孢菌属，隐球菌属，青霉属和红酵母属。虽然一些真菌如马拉色菌属（Malassezia）是真菌性角膜炎的罕见病原体，但它们仍可能与眼部健康和疾病有关。这些属在真菌性角膜炎发病机制中的可能作用需要进一步研究。

总之，本次的研究通过高通量测序揭示了眼球表面的真菌群落。虽然无法确定在正常眼表上鉴定的真菌是否具有致病性，但研究结果可能为进一步研究真菌在真菌性角膜炎中的可能作用提供了框架。还需要更多研究来验证健康眼表和真菌性角膜炎之间是否存在真菌改变，这可能有助于更深入地了解微生物 - 宿主和微生物 - 微生物的相互作用，促进寻找新的疗法，如调节真菌或细菌微生物组成

结论

本研究采用了高通量测序法对正常人眼表真菌菌群进行了鉴定，为进一步研究真菌菌群在眼部健康和疾病中的潜在作用奠定了基础。

参考文献

Yuqian Wang  et al. Characterization of fungal microbiota on normal ocular surface of humans. Clinical Microbiology and Infection. doi.org/10.1016/j.cmi.2019.05.011.

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