PBMC单细胞研究汇总 | 单细胞专题

继上一期乳腺癌单细胞研究汇总（乳腺癌单细胞研究汇总）之后，联川生物继续推出PBMC单细胞研究汇总，向您介绍以PBMC为研究对象的单细胞文章。本篇稿件内容包括PBMC分离方法和PBMC单细胞研究文章简单介绍。

1PBMC定义

PBMC（peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞），其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ/Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分。

2PBMC分离步骤

1. 抽取5毫升血液，置于柠檬酸钠抗凝管。如果血液不能立即处理，室温下摇动储存，并在24小时内处理（最好立即处理）；

2. 将试管轻轻倒转8次混合血液，按1：1加入PBS稀释血液；

3. 取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。

4. 移液管吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面（移液管不能伸到分离液的液面以下，离心管（含5mL淋巴分离液）与水平面呈45度角，移液管的下端靠近分离液的液面，轻柔地加入血液-PBS混合液，随着混合液的加入，移液管也缓慢上移，使混合液体缓慢流下）。

5. 室温，800g离心30min（若血液分离前留置过夜，以相同速度离心40分钟为佳）；

6. 离心管中形成4层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层，呈白膜状（下图Buffy coat），最下层为粒细胞和红细胞。

7. 小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量将PBMC全部吸出（注意不能吸到下层的淋巴细胞分离液，因为若掺入分离液，后续离心的时候就会损失掉一部分细胞）；

8. 估计出吸取的PBMC的体积，向离心管中的PBMC中加入至少3倍体积的PBS溶液，轻轻倒置管混合。

9. 室温下310-400g离心10-15分钟；

10. 弃上清，轻拍试管侧面，然后加入加入6 - 8mL PBS并轻微吹打；

11. 室温下310-400g离心10分钟;

12. 去上清液，加入1mL 1640培养基并混匀，取少量进行细胞计数并检测细胞活性。

3PBMC单细胞文章简介

【题目】人类T细胞的单细胞转录组学揭示了健康和疾病中的组织和激活特征【发表期刊】Nature Communications【影响因子】12.124【发表时间】2019.10【文章摘要】人类T细胞通过产生细胞因子和效应分子，在不同的环境中协调适应性免疫，但尚不清楚组织位置如何影响T细胞的持久性和功能。该科研团队使用scRNA-seq来定义从肺、淋巴结、骨髓和血液中分离的人类T细胞的异质性，以及它们在受到刺激后的功能反应。通过分析> 50000个休眠或激活的T细胞，揭示了组织T细胞在粘膜和淋巴部位的特征，以及所有部位的家族特异性激活状态，包括CD8⁺T细胞的不同效应状态和CD4⁺T细胞的干扰素响应状态。与肿瘤相关T细胞的scRNA-seq数据比较，可以发现在多种肿瘤类型中，与CD4⁺T细胞状态相比，CD8⁺主要处于激活状态。因此，该研究结果为分析疾病中的T细胞建立了健康中T细胞活化的高维参考图。【研究结果】该结果揭示了人类血液和组织来源的T细胞的保守功能状态。CD8⁺T细胞根据参与细胞毒性的基因(细胞毒性模块)和无数细胞因子和趋化因子(细胞因子模块)的表达分为两个主要的效应亚群。这些被激活的人类CD8⁺T细胞的主要效应状态与小鼠CD8⁺T细胞激活引发效应分化的结果一致。科学家们还发现了两种主要的激活状态，它们与效应作用无关：一种激活状态与增殖和IL-2的产生有关，另一种激活状态富集于CD4⁺T细胞。

【题目】调节性T细胞的单细胞转录组学揭示了组织适应的轨迹【发表期刊】Immunity【影响因子】21.522【发表时间】2019.2【文章摘要】Treg细胞是已知的显示组织特异性异质性的细胞。研究团队通过单细胞转录组研究淋巴和屏障组织中的Treg细胞。结果表明，Treg细胞沿着组织适应的连续体分裂成亚群，并在稳态、疾病的小鼠和人类之间表现出保守的表达程序。【主要结论】Treg细胞具有组织特异性特征，其表型表现出对屏障组织的逐步适应。Treg细胞对结肠和皮肤的适应具有转录动力学特征。非淋巴组织(NLTs)中存在大量适应性免疫细胞，其表型和发育尚未被研究。该团队使用单细胞RNA-seq检测小鼠皮肤和结肠、引流淋巴结和脾脏中35000个CD4⁺调节(Treg)和记忆(Tmem) T细胞。在这些组织中，发现了具有不同程度NLT表型的Treg细胞亚群。亚群伪时间序列和基因动力学在皮肤和结肠的招募上是一致的，然而LNs的初始NLT启动和NLT功能适应的最后阶段反映了组织特异性的差异。利用体内黑色素瘤诱导模型，验证关键的调节因子和受体，对预测的动力学进行了概括。最后，分析了人类血液、NLT Treg和Tmem细胞，并鉴定了跨哺乳动物的保守组织特征。总之，我们通过结合计算预测和体内验证来描述Treg细胞异质性和NLTs招募之间的关系。

【题目】利用单细胞RNA测序和细胞代谢谱分析DENV疫苗诱发的细胞免疫异质性【发表期刊】Nature Communications【影响因子】12.124【发表时间】2019.8【文章摘要】产生有效和持久的T细胞免疫是预防登革病毒(DENV)和其他病毒性疾病的关键先决条件。然而，了解疫苗诱导T细胞免疫的分子机制仍然是疫苗学的一个重要知识空白。在这项研究中，我们利用scRNAseq和TCR分析来识别一个独特的转录特征，它存在于急性激活和克隆扩增的T细胞中。这种效应/记忆相关的转录是由一个强大的代谢转录程序主导。基于这一转录特征，我们能够定义一组标记来识别最持久的疫苗反应性记忆前体CD8⁺T细胞。本研究阐明了scRNAseq作为一种分析工具，以评估宿主控制的分子机制和疫苗模式，从而确定疫苗诱导的细胞免疫的大小、多样性和持久性。【文章结论】在这项研究中，该证明了减毒四价DENV活疫苗TAK-003能够诱导有效和持久的细胞免疫。TAK- 003给药后CD8⁺T细胞激活在接种后28天达到高峰，而CD4⁺T细胞在接种后第14天出现最大扩张。DENV特异性细胞免疫持续至少120天免疫接种后评估的有关酶联免疫斑点。IFN-γ TAK -003诱导的细胞记忆免疫反应的抗原特异性跨越整个DENV蛋白组，对所有四种DENV血清型均表现出明显的交叉反应。使用scRNAseq对接种后14天接种的TAK -003-刺激的CD8⁺T细胞进行克隆型和功能多样性分析，发现表型同质人群中存在大量的转录异质性。分离和基于scRNAseq的分析表明，接种后120天NS1和NS3反应性记忆CD8⁺T细胞群中占主导地位的TCR也可以在接种后14天激活的CD38+HLA-DR+CD8⁺T细胞观察到。以scRNA-seq为基础的对接种后第14天出现的这些记忆前体细胞的分析显示了一个独特的转录特征，由与细胞代谢和增殖相关的基因表达途径主导。

【题目】急性中风幸存者的系统反应的一年免疫状况【发表期刊】Brain【影响因子】11.814【发表时间】2019.4【文章摘要】中风是认知障碍和痴呆的主要原因，但中风后认知能力下降的机制尚不清楚。脑卒中产生深刻的局部和全身免疫反应，包括所有主要的先天和适应性免疫区。然而，对中风的系统免疫反应是否导致长期残疾仍不清楚。研究者们使用单细胞计数法对24例患者1年的纵向血样进行了系统免疫反应的全面和功能的描述，并将免疫反应与卒中后90天至365天的认知功能变化进行了关联。利用回归模型，确定了发生在三个阶段持久的系统免疫反应的关键因素。急性炎症期网络模型与卒中后认知轨迹相关。结果表明，一种深度免疫分析方法和大量细胞分析技术在识别长期认知轨迹的临床相关免疫相关性方面是有效的。【主要结论】本研究采用深度免疫分析方法来描述急性缺血性脑卒中后1年内患者的系统免疫反应。对纵向巨细胞分析数据集的高维弹性网络分析确定了三个免疫阶段，这三个阶段的特征是卒中后先天和适应性免疫室的连续参与。在急性期(中风后第2天)测量的免疫反应和长期的认知轨迹之间存在很强的相关性。该分析确定了三种严格统计的弹性网络模型，强调了卒中后急性期(第2天)、中期期(第5天)和晚期期(第90天)的免疫阶段。弹性网络模型的组成部分被整合到相关免疫特征的群落中，揭示了每个免疫阶段的主要生物学特征。例如，急性期模型的组成部分显示了一个特定的转录事件(STAT3磷酸化)在多个先天免疫细胞亚群中的共享激活。相比之下，中间阶段模型的组成部分显示了适应性免疫细胞中CREB信号通路的多个元件的协同活动。此外，晚期模型还发现了几种持续的免疫反应。因此，该分析强调了整个细胞网络图，而不是孤立的信号事件。它还确定了在中风事件后至少持续90天的免疫学特征。结合后期的认知结果，这突出了研究卒中幸存者在卒中后至少3个月的长期外周免疫系统状态的价值。本研究为今后针对特定标志物和细胞类型的更全面的人体研究奠定了基础。它的目的是为了回答是否可以追踪外周血中与中风相关的表型和功能性免疫变化。在一年的时间里，抗体板用于分析所有主要免疫成分。在此提供的细胞特异性免疫信号反应的分析框架和时间安排，为今后确定卒中后长期功能和认知轨迹的免疫预测因子奠定了基础。

【题目】单细胞RNA测序解决了人类胚胎胸腺前淋巴祖细胞和胸腺器官发生的时空发展问题【发表期刊】Immunity【影响因子】21.522【发表时间】2019.11【文章摘要】对人胚胎早期T淋巴细胞生成和胸腺器官发生缺乏全面、准确的认识。科学家们通过对人胚胎和胎儿造血器官进行单细胞转录组分析，揭示了早期胸腺祖细胞的不同亚群，识别了胎儿肝脏的胸腺种子祖细胞和主动脉-性腺中性系区域的胸腺前淋巴祖细胞，并对早期胸腺上皮细胞的发育进行了描述。【主要结论】人类胚胎中第一代T淋巴细胞的产生涉及到淋巴祖细胞的产生、迁移和胸腺的播撒，并伴随着胸腺器官的发生，这是建立整个适应性免疫系统的第一步。然而，调控这一过程的细胞和分子机制仍不清楚。该课题组利用跨越胚胎和胎儿阶段的多个造血和造血位点的细胞，构建了人类早期T淋巴细胞生成的单细胞转录景观。在异源性的早期胸腺祖细胞中，有一个亚型与胎儿肝脏中淋巴样祖细胞具有共同的特征。生物信息学分析在主动脉-性腺-中肾(AGM)区发现了一种独特的胸腺前淋巴祖细胞。同时，我们还研究了胸腺上皮细胞的发育和胸腺器官形成过程中细胞与细胞间的相互作用。总之，该研究为人类早期的淋巴细胞生成提供了见解，并有望指导T淋巴细胞的再生，这可能会导致临床应用的发展。

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