Current Opinion in Plant Biology|树木茎型遗传调控综述和基因克隆方法启示录 | 群体遗传

摘要所有植物的向性生长都涉及向光性和重力响应。因此，整个植物王国中控制茎型发育的机制会类似。但是，由于不同物种形式各异（部分原因是基因拷贝数和功能分化），植物如何预先确定和调节结构的某些方面会有所不同。比较一年生草本植物（比如模式植物）和多年生木本植物（比如树木）时尤其如此。在过去的十年中，廉价的基因组测序和技术进步使树木中的基因发掘和功能研究得以实现。这导致控制树木茎型相关的基因鉴定成为可能。本文就呈现了最近的树木类物种中调控茎型（矮化，垂枝，柱状生长和树干生长习性等）基因鉴定的研究。此外，还讨论了这些发现的潜在应用。

前言树木类物种生产的水果+坚果；林业产品每年分别产生了超过250亿和2000亿美元的产值。此类具有重要经济价值的树木茎型（高，节间长度和分支方向）对管理、生产力和可持续性均有重大影响。对果树这种需要控制大小和形状的树木而言尤其如此。但是，分子标记辅助选择、遗传工程和基因编辑技术将很快使培育环境友好型、易密植和易于机械化的品种成为可能。
株型或者说是植株的生长习性既是静态的，也是可塑的。对于每个物种，基本形式是遗传编码，但是为了生存，植株必须不断的响应来自外界的刺激，比如光照、外力和重力。这个过程由遗传，环境，激素，水力，营养元素，细胞分裂、大小和细胞壁成分构成的复杂网络调控。这个网络还包含了营养生长的时间、花分生组织的发育、分生组织的位置和组织、各自的芽或花出现的时间。此外，所有方向和大小生长响应都和植物激素（生长素，赤霉素，油菜素内脂，独脚金内酯以及下游的信号组件）的集中度、位置和感知关联。与短寿命和柔软的草本植物相比，调整树木的生长更加复杂，甚至是更加重要。每个生长季节，树木的分枝变得更加僵硬和固定，这限制了他们重新定向的能力。因此，树木的生长决定比一年生植物更具风险，因为他们会影响长期的生存。所以在某些方面，模式物种比如玉米或者拟南芥不适宜类比研究树木。虽然很多潜在的遗传和分子驱动因素在所有植物中都类似，但是研究树木特异的株型控制机制显得非常重要。此外，调查研究不应该局限于一种物种。树型和它的驱动因素，就像树家系一样，可能非常多样化。即使在同一个家系中，也可能如此。比如在蔷薇家族中，樱桃和桃子符合Rauh株型模型，杏子展示出的是Champagnat模型，而苹果却因成熟和生殖分生组织位置不同展示出从Rauh到Scarrone的模型。本文综述了树木中茎型的遗传和分子调控机理。更具体的是，我们address茎的发育方向、分枝角度和株高性状上已经被验证过的调控基因。树木矮化相关基因植物中引起矮化的原因多种多样。在树木中，正如在模式草本物种中一样，矮化和GA素生物合成和信号基因之间的联系已经被发现。桃中一个隐性的矮化是由于基因GA受体基因GID1c的一个无义突变。功能验证发现，李子中通过RNAi 沉默GID1c，发现该基因的抑制程度和矮化程度一致。这个发现能直接利用到树木育种中，可随心所欲的调节植株高矮。后续在另一个桃树品种中，一个基于传统的定位方法的研究也发现矮化和GID1c的关联，但是是另外一个allele，且是promoter区的突变引起。树木的矮化也有可能是WRKY9的表达增加引起。WRKY9是一个转录因子，能够抑制BR生物合成基因DWF4的表达。苹果矮化砧木中WRKY9高表达，半矮的苹果砧木中，过表达WRKY9导致矮化。这种矮化效应能被施加外源的BR部分的解除。有趣的是，和对照相比，IAA，CK或者GA均未表现出差异。因此，降低BR含量能极大地引起树木的矮化。过表达NAC1转录因子也能诱导矮化的苹果树。BR和ABA的含量在NAC1过表达的植株中降低，也降低了BR和ABA合成基因的表达。前人的研究也支持NAC基因负调控株高。比如在拟南芥、水稻和杨树中，过表达NAC的同源基因也会引起矮化表型。其他的树木矮化表型遗传关联分析鉴定到了一些QTLs，但是需要进一步的研究确定causal基因。这些见解能让我们微调植株大小成为可能，也为种植户利用外源激素调控生长提供可能。左图正常表现；右图矮化性状表现
WEEP基因引起桃垂枝表型一个叫做WEEP的基因缺失是桃表现出垂枝（枝条椭圆形生长）的原因。WEEP是一个未知功能的植物特异性小蛋白，具有高度的保守性，在维管束植物中，该基因的同源基因具有90%以上的蛋白序列相似度。这种高度保守性暗示WEEP处于显著的选择压力之下，并且对于生长发育十分重要。有趣的是，拟南芥中weep突变体并没有明显的表型，原因可能是由于十字花科特定的突变在一个保守结合域中。依据桃的表型发现WEEP似乎改变了生长方向，并有助于对重力产生响应。另外，树干上的分枝只是减少了，并没有完全消除。通过RNAi干扰WEEP表达，桃表现出蜿蜒、生长方向和茎的方向都不确定性现象。在垂枝的桃树中，很多细胞壁相关、细胞骨架基于都有差异表达，表明定向生长是受到细胞壁生物合成/结构干扰。WEEP基因的鉴定提供了宝贵的茎方向调控见解，但是垂枝结构可能只是观赏植物所必须的，跟农作物类树种关系不大。但是，解码它的分子功能也许能够鉴定哪些能使农业受益的基因。此外，对WEEP基因的研究能发现植物中和重力响应有关的新的信息。左图正常表现；右图垂枝表现苹果柱状树型和反转录转座子、2OG-Fe（II）加氧酶有关苹果柱状树型生长习性的遗传控制基础已经被证明是难以捉摸而且存在争议的。理想的高密植、柱型树型意味着树小且纤细，节间较粗，分枝短，侧枝多。对之前鉴定到的该性状QTL精细定位的结果强化了这个假说：一个未知功能的转座子诱导2OG-Fe（II）加氧酶上调导致柱状树型植株且节间缩短。过表达该基因减少了烟草和苹果的节间长度。但是，额外的表型可能和该locus的其他基因有关。另有一项诱导苹果早熟的研发发现，LEAFY的过表达也会导致苹果中株型树型的表型产生。左图就是正常性状表现；右图就是柱状树型性状表现TAC1基因增加分枝角度TAC1基因能提升植物外侧茎生长。在水稻、玉米、芒草、拟南芥、桃、李中抑制或者敲除TAC1基因均表现出直立生长习性和小的分蘖角度。水稻、李和杨树中过表达TAC1基因导致更大的分蘖/枝角度。桃和拟南芥也表现出一定的剂量依赖型表型。植物杂合子tac1缺失型表现出中间型的分枝角度。Tac1 allele突变型桃（纯合或者杂合）由于其更窄的分枝角度而被商业化推广。TAC1在桃、杨树和拟南芥的茎组织中表达，响应光合作用信号的光下游，调控侧向器官发育方向。光上调其表达，长时间黑暗终止其表达，被2个光合抑制剂所抑制，但在光合受体和光信号突变体中表达变化不大。此外，在正常光照环境下，拟南芥tac1突变体表现出窄的分蘖表型，暗示垂直分蘖方向可能是默认的方向，需要TAC1来促进宽的分枝角度和向外的分枝方向。现有的对TAC1功能研究成果能培育更窄分枝角度的果树以及木材用树种，增加种植密度。然而，育种进程中，需要考虑分枝的强度。附着强度和枝干直径比高度相关，但是由于增加了树皮包裹的可能性，更窄的树杈角度主干更容易被折断。光截获的变化也需要被考虑，尽管能通过修剪来弥补光线减弱。左图正常表现；右图直立分枝角度表现
LAZY1 促进茎上举，减少分枝/蘖夹角和TAC1相反，IGT家族成员LAZY1通过重力响应pathway促进茎上举发育。降低或者不表达LAZY1的植物具有大的茎角度，茎的引力缺陷以及生长素运输受损，但是仍然有功能性的造粉体存在。已经有几个树木特异性的LAZY1调控茎方向和应用的案例。过表达LAZY1导致杨树直立生长且分枝夹角小。反之，LAZY1沉默的李树出现蜿蜒、垂枝的表型，缺乏明确的增长轨迹。桦树中相关研究发现一个LAZY1同源基因无义突变的垂枝性突变体。在苹果的垂枝品种中定位到了四个QTL，其中一个QTL中含类LAZY基因。虽然LAZY1的确切分子机制尚不清楚，但是来自多个物种的实验提供了许多线索。脂膜，核和微管之间的关联性已经被生化，荧光蛋白和体外实验揭示。此外，LAZY1的EAR motif可能具有转录抑制活性。但是，细胞核定位也许不被需要用来研究茎定位的功能，核定位信号突变体中LAZY1的表达能拯救拟南芥的表型。报告基因和qPCR实验表明LAZY1在茎组织（包括内胚层）中表达。水稻中HSF2D基因快速响应重力刺激，正调控LAZY1的表达，促进不对称的生长素定位。有趣的是，玉米中，ZmLAZY1蛋白和AUX/IAA蛋白IAA17在细胞核，和生长素转运调控激酶PKC在脂膜中均有互作，提示LAZY1在生长素信号转导和生长素运输中起作用。此外，水稻中过表达生长素外排蛋白OsPIN2能降低LAZY1表达，表明LAZY1表达和LAZY1介导的生长素转运存在反馈调节。其他五个拟南芥中的LAZY基因并没有独立明明，造成了潜在的混乱。有些后来克隆的基因被命名为DRO，NGR，LZY。这六个基因中，LAZY1是主要的茎角度和茎重力响应调控者，其他的通过相同的机制或主要或单独指导根系角度和根系重力响应。但是，LAZY2和LAZY4有相同的茎（下胚轴）表达模式，lazy1分枝表型和茎向重力缺陷被lazy1和lazy4突变增强了，表明存在部分冗余效应。另外，内皮上的LAZY2或者LAZY4表达能拯救严重茎引力缺陷突变，表明这些基因存在功能上的冗余。尽管在LAZY1的研究上取得了一定进展，但是LAZY1和其他LAZY基因在连接重力感应和生长素不对称分布上仍不清楚。但是改变LAZY1表达提供了一个修改分枝角度的靶标，并且减少LAZY1的表达可能导致果树分枝角度变大，是理想的二维高密度种植框架系统。LAZY1，TAC1和WEEP基因的互作这部分与靠谱er想表达的地方相去甚远就不翻译了，感兴趣的小伙伴儿们可以看原文去。

通过本文，靠谱er想夹带的私货如下：1. 植物界的某些基因具有广泛的同源性（直系同源），尤其是具有相似表型的基因。这意味着通过挖掘模式物种和非模式物种中存在的信息差（信息红利），仍然可以进行短平快的小产出。具体细节就不多说了。
2. 保守基因往往具有冗余效应（若干个copy），目前靠谱er尚未发现有专门研究这类冗余效应基因的特征和调控类的文章，但是随着越来越多的物种基因组数据被释放、越来越多的保守基因被克隆，预计很快就会有这方面的文章出来（靠谱er斗胆预言3-5年时间内）。3. 林木类物种的基因克隆方法。基因克隆有3个方法，分别是基于群体的正向遗传克隆，基于组学的反向克隆和基于已知基因的同源克隆。本文中树木中株型相关基因多数在其他物种中有同源基因，且均为组成型表达，故同源克隆方法较多，反向遗传克隆基因的案例较少。基于群体正向克隆从2000左右一直到现在均有报到，而且逐渐的和NGS技术相结合，大大加速了木本物种基因克隆的进程。现举例如下：正向遗传克隆：比如桃树中dw基因（GID1）是基于112个遗传群体重测序BSA定位分析并进行非同义突变位点筛选后获得（Hollender C A et al., 2016）。该策略能成功的原因之一是这112个子代群体由目标区间杂合的亲本自交后获得，这样分离群体的遗传背景较为纯净，BSA定位时结果更加准确，另外还带有一些运气成分。但是某些自交不亲和的树木就无法构建这种群体了。又如利用传统遗传图谱QTL定位法，鉴定到桃树中GID1新的allele（Cantín C M et al., 2018）。比较罕见的是该遗传群体用到一个F2群体，数量69个，而一般林木类物种很少有F2群体，该文有一个前提是本群体的矮化基因和GID1是等位基因，但是，本文并未做等位性鉴定，也是这篇文章潜在的风险。下一个案例，桃的垂枝性状基因定位（Hollender C A et al., 2018），这个案例更符合NGS时代的基因定位特征。该文利用垂枝（19个）和正常枝条表型（55个）的自然群体进行混池分析（这种混池用得极少，前提之一是该控制性状的位点单一，要不然结果会一团糟），做一个初定位，然后利用91个F2群体材料构建遗传图谱（芯片genotyping）进行共定位，获得可靠的候选基因区间。利用4个家系群体（453个材料）精细定位，包括设计KASP标记等等方法，将区间锁定在435Kb的区间，又做了转录组进行候选基因筛选。本文用到的方法和技术可谓眼花缭乱，但也是为了弥补林木类物种正向遗传克隆基因先天不足（短时间无法构建各种高代群体），而不是单纯堆砌数据。后边靠谱er会给大家详细分享这篇paper的思路。同源克隆：基于拟南芥中GAI基因的功能和表型，将其转入到杨树中，也发掘到了类似拟南芥矮化的表型（Busov V et al., 2006）。其他案例靠谱er就不一一列举了。长远来看，从植物基因克隆角度来说，以后同源克隆相关的研究会越来越少（作物中同源克隆在10年前还比较普遍，近年来此类研究也越来越少，林木物种也难逃宿命）。同源克隆严重依赖于不同物种之间相似表型的基因的保守性，且无法获得novel基因和物种特异性基因，以后如果研究模式物种或者作物的老师进行跨物种拓展研究的话，可能同源克隆就只限于该课题组了（有点夸张了）。后台回复林木株型基因克隆综述获取原文
参考文献Hollender C A , Hadiarto T, Srinivasan C, et al. A brachytic dwarfism trait (dw) in peach trees is caused by a nonsense mutation within the gibberellic acid receptor PpeGID1c[J]. New Phytologist, 2016, 210(1): 227-239.Cantín C M, Arús P, Eduardo I. Identification of a new allele of the Dw gene causing brachytic dwarfing in peach[J]. BMC research notes, 2018, 11(1): 386.Hollender C A, Pascal T, Tabb A, et al. Loss of a highly conserved sterile alpha motif domain gene (WEEP) results in pendulous branch growth in peach trees[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(20): E4690-E4699.Busov V, Meilan R, Pearce D W, et al. Transgenic modification of gai or rgl1 causes dwarfing and alters gibberellins, root growth, and metabolite profiles in Populus[J]. Planta, 2006, 224(2): 288-299.
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