左手遗传图谱右手肠道菌群，嘿，ISME文章！| 群体专题
群体遗传学和微生物组学，这两个看似八竿子打不着的组学是如何在作者手中糅合在一起，并且斩下高分杂志ISME的青睐呢？
文献实验设计和主要结论，大家移步【微生物组用户ISME文章：宿主性别可以决定肠道微生物对寄生虫感染的响应 | 微生物专题】。本次主要拆解一下这篇文献的斩分秘籍。
STEP1：盲生，你发现了华点
充分的前期调研是高分文章的必经之路，经过对28篇研究文献的阅读分析和总结，作者发现进化生态学家和生物医药研究者对于宿主-寄生虫-微生物响应方面的研究，主要得到三类结论：微生物对寄生虫感染行为没有影响；微生物在感染过程中参与抵抗寄生感染或疾病作用，从而保护宿主；微生物助长寄生虫的感染。
咦？什么结论都有，难道这个影响关系这么难研究吗，那我来看看主要都是怎么回事。
1. 三角关系真的很麻烦：
1.1微寄生虫可以通过分泌抗菌肽直接影响肠道微生物。（嗯，够直接，小三直接挑衅原配）
1.2寄生虫也可以通过改变宿主的生理机能和免疫系统来影响肠道微生物（嗯？绿茶婊？）比方说：H. polygyrus感染小鼠后通过抑制肠粘膜白介素IL-17和IL-22的分泌，从而减少宿主分泌上皮细胞抑菌肽。
2. 不论是直接影响还是间接影响的方式，整个作用机制是很难阐明的：
2.1一般，关注间接影响的一个策略是研究生活在肠道外的寄生虫，它们在物理上与肠道微生物隔离(尽管分泌的产物仍可能扩散到肠道腔内)。
2.2另一种策略是检测宿主基因型，是否调节了寄生虫对菌群的影响。
这样看来，直接影响作用应该仅与寄生虫和微生物有关，而对宿主基因型不敏感。而间接影响则相反，应该与宿主基因型敏感，主要是通过宿主免疫响应来影响微生物的。那么除了与免疫基因变异相关以外，那与性别也会有一定关联，因为性染色体调控免疫特征啊。
从文献堆里回头看看，以基因型和性别作为切入点的设计逻辑没毛病，好像也确实没什么人研究。
虽然这个推论我们现在没啥论据，间接作用好像也比较难研究，但是我们这么优秀的人怎么能退缩呢。火速进入下一步！
STEP2：先做个小实验看看有没有继续挖掘的价值吧
Gosling 湖我看着就挺好的，大手一挥这个鱼塘我包了！
野生GOS种群的棘鱼亲本杂交，形成6个实验室喂养的全同胞家系群体，暗搓搓地在喂养饵料（桡足动物，第一宿主）的时候加点料（裂头绦虫Schistocephalus solidus，棘鱼的天然寄生生物）然后把待有绦虫的饵料喂给实验组（坏滴很）。对照组则继续投喂无加料的饵料。
检查一下棘鱼的身体情况，裂头绦虫感染后会寄生在宿主的腹腔内，以此给这些鱼划分成3个组别：无暴露对照组，暴露但未感染对照组和感染组。
那就测一下16SV4V5吧，我倒是要看看宿主家系、暴露行为和是否感染，到底对肠道微生物的菌群有什么影响。
在进行PCoA分析时，仅选取PCoA axis1作为纵坐标，设置暴露条件为横坐标，将暴露组（含感染和未感染）与无暴露对照组进行对比分析，6个全同胞家系中只有1个家系的菌群有明显抑制，作者得出结论：寄生虫暴露组的肠道菌群与对照组之间有明显差别，在暴露条件和家系的共同作用下，菌群丰度差异是显著的。
于是作者把暴露条件去掉，只看是否感染的情况，将组别分为未感染组（含无暴露，暴露未感染或者感染失败），与感染组进行对比分析，则发现二者的菌群丰度之间没有明显差异。
裂头绦虫感染后寄生于腹腔，不直接接触肠道微生物，而这个实验的分析结果说明家系确实是影响菌群结构的重要影响因素之一。这个结果有点东西啊，可以继续搞！
STEP3：怎么对性别（性染色体）和基因型进行鉴定和区别呢
兜兜转转寻寻觅觅，作者发现Roberts湖的风景也很好，更好的是这个湖里的棘鱼和Gosling 湖里的鱼群在野生环境中的绦虫感染率等指标就有很大的区别，而且免疫系统相关的基因型也是不一样的。
作者眉头微微一皱，发觉这事不简单，那就先构建个遗传群体吧，于是大手又一挥，这个鱼塘也承包了！
承包了两个鱼塘的作者就豪横了起来，先是捕捞Gosling 湖（GOS）和Roberts湖（ROS）里的野生棘鱼带回实验室进行杂交培养，构建了F1群体，然后将F1群体分别与GOS亲本、ROS亲本进行回交，又在F1群体内杂交形成一系列F2群体。然后又开始暗搓搓搞事情了，投喂一段时间后，F2群体内也自然地分为了感染组和未感染组：711条F2代被害鱼中有256例成功感染上裂头绦虫。
遗传群体构建完了，那我们看看在寄生虫这个小三的插足之后，宿主和肠道微生物之间发生了什么变化。于是对GOS、ROS亲本和F2群体分别进行ddRAD测序，对其中693个个体的肠道（内容物）样本进行了16SV4V5测序。
微生物多样性分析
经过GLMs分析，在棘鱼肠道中pick到菌群丰度最高的TOP5分别是厚壁菌门（61.07%）、变形菌门（28.68%）、放线菌门（5.13%）、拟杆菌门（0.93%）和浮霉菌门（0.67%）。作者掏出文献一看，已有研究表明：即使年龄饮食等情况一致，棘鱼体内微生物菌群多样性的个体差异也是非常明显的。嗯，看来还不能直接出道，那得细化PK赛制了。
＊宿主性别、杂交系和感染情况共同影响肠道菌群：
第一轮PK首先筛掉鉴定个体数少于20的，然后选取”路鱼缘”最好的TOP84个菌群（目水平上鉴定到的样本数量降序），进行新一轮的数据分析和挖掘。
此时需要引入几个关键指标作为”导师”了，首先是空间效应用来评定每个实验个体的饲养空间影响。在目水平上，宿主性别、杂交系和个体质量，对这84种菌群的丰度影响占比分别有32.1%,，35.7%和28.6%。很出乎意料的是，理论上应该成为主要影响因素的感染情况，竟然只有微弱的7.1%的占比。难道是否感染这个条件就一点都不重要吗？
当感染因素与杂交系联手时，22.6%的菌群有明显响应；21.4%的菌群对于感染因素与宿主性别的联手有明显响应；而感染因素与个体质量的联手影响力则比较微弱只有11.9%。看来统计学意义上来说，在菌群互作中发挥主要影响作用的就是宿主基因型了（性别，杂交系）。
以上分析都是以目水平来开展的，那么其他分类层级上的情况呢？作者对其他层级均进行了统计学分析，发现这个规律在各个层级中均有发现。
嗯，做到这儿作者摸了摸下巴，只有干巴巴的数据对于展示结果非常不友好，那让我来举个栗子，绘制一个”非常规”热图，给大家舞台初演的机会，看一看TOP84的表现到底如何：
看看这密密麻麻的色块，这几个影响因素算是选对了。给自己手动点个赞，鸡血打满继续PICK！
＊寄生虫感染与宿主基因型相互作用的举栗：
TOP84还是太多了，出道是不能都出道的。对各个因素条件下，菌群丰度差异显著性P值进行筛选，给P值小于0.001的5个菌群更大的展示舞台：
梭杆菌目（Fig.3a）和乳酸杆菌目（Fig.3b）在感染个体中丰度均有明显变化，且在不同性别（雄黑雌灰）组群中的变化趋势一致。
梭菌目（Fig.3c）在雄性感染个体中丰度有明显下降，而雌性感染个体中则没有明显变化，然而所有感染个体中的丰度情况比较相近；红细菌目（Fig.3d）也表现出了明显的性别x感染因素作用。不同性别的宿主在感染前后，肠道中红细菌目的丰度变化完全相反：雄鱼中有明显升高而雌鱼中有明显下降。
那杂交系的大舞台表现如何呢？
在Fig.3e（柄杆菌目）和Fig.3f（红细菌目）中，横坐标为F2杂交系因素，依次为GOS 回交群体（GBC），F1内杂交系（F2）和ROS回交群体（RBC）。对于柄杆菌目而言，在F2群体中的丰度最高，GBC或者RBC的亲本回交系中丰度都明显处于很低的水平，而是否感染（黑线未感染，灰线感染）并没有引起丰度的明显变化。
红细菌目的表现则很有意思：在F2群体中：感染前后均有较高丰度，感染后略有上升；GBC群体中：感染前丰度明显低于其他群体，然而感染后却有明显的丰度上升；而RBC群体则在感染后出现了明显的下降。
好了，性别和杂交系对感染前后宿主肠道菌群的影响基本是实锤了，可以说是求锤得锤。
＊寄主杂交和性别对微生物群的鉴别功能分析
Fig.4a中LDA axis1区分感染情况：被感染个体为实心点，未感染个体为空心圈；LDA axis2区分性别：蓝色代表雄性个体，红色代表雌性个体。
Fig4b中LDA axis1区分杂交系情况：蓝色代表GBC群体，红色代表RBC群体，紫色则代表F2群体；LDA axis2没有展示在此；LDA axis3则区分感染情况：被感染个体为实心点，未感染个体为空心圈。图中放大标注的是各自分群的双变量平均值。由此可以解读如下：
1）Fig.4a中可以看到，在LDA1（横坐标）上，雌性鱼群感染前后的菌群情况可以明显区分，而雄性则比较贴近；在LDA2（纵坐标）上则可以明显区分开不同性别的组群。说明雌性个体的肠道菌群更易受到寄生虫感染的影响。
2）Fig.4b中可以看到，在LDA1（横坐标）上，F2群体可以与RBC或者GBC明显区分开，而GBC和RBC基本在同一位置，说明在肠道菌群结构上，可能存在超亲遗传效应；
3）Fig.4b中在LDA3（纵坐标）上，可以看到未感染寄生虫时，3个群体的肠道菌群基本在同一水平；而感染后GBC和RBC可以明显区分，而F2群体中的组群之间则没有明显区分。由此可以说明，F2群体的肠道菌群对寄生虫感染不敏感，而GBC和RBC的肠道菌群或多或少都对寄生虫感染发生了响应。
遗传群体分析
经过对构建的3个遗传群体和野生亲本的ddRAD测序，遗传图谱构建分析，确定了234个在GOS和ROS中差异固定，且在F2群体中测序深度足够的SNPs标签。这些有效SNPs标签大约以每个连锁群上存在10个标签的比例分布。
STEP4：微生物菌群也分析了，群体数据也分析了，怎么给他们duang起来加个特效呢？
做群体遗传学分析，肯定也绕不过QTL分析啦，但是QTL分析也需要和表型结合呀，常规分析都是以实验个体的表型信息来分析的，但作者手上只有性别和肠道微生物结构数据，性别就是性染色体决定的，而肠道微生物属于体外环境。体外环境可以作为表型信息进行QTL分析吗？要不试一下？作者小小的脑袋里有大大的问号，转念一想，好不容易做出来的数据都挖掘到这儿了，试试就试试，谁怕谁啊！
＊肠道菌群组成的QTL定位分析
在对前10个加权PCoA axis和微生物多样性进行QTL分析都没有得到显著结果后，作者对在未加权的PCoA axis5上确定到了3个勉强高于严格阈值的弱效应QTL结果。但是当使用LDA分析将多个PCoA axis合并成单一度量指标时，这个信号值被放大了，因此作者在Chr9上发现了一个支持度良好的QTL区域可能影响肠道微生物结构，并且经过同课题组其他成员的研究分析，Chr9上不存在对绦虫感染成功率造成显著影响的QTL区域。由于对微生物分类指征强有力的QTL结果的缺乏，作者引出了一个假设：
宿主基因型对整个肠道微生物结构的调控，极有可能是多基因控制的。而且如果宿主基因突变只对特定微生物的丰度造成调控影响，那相对而言对整个菌群结构分析的PCoA score值而言，显著性就可能会很微弱，从而很难得到比对结果。
于是作者将目水平的微生物丰度作为表型信息，对所构建的3类F2代群体分别进行QTL比对分析，并且真的还就获得了大量针对特定微生物的QTL结果，而且科水平上也有相似的定性结果。
由于QTL分析是针对不同群体分别进行的，作者把空间效应作为附加协变量进行分别分析后，将不同群体的LOD值结果进行汇总绘图。上方图中的黑色粗线为各个连锁群上的汇总LOD值，灰色的阴影线则是汇总前各群体内的LOD结果。
以梭杆菌目的分析结果为例，在Fig.5a的LOD分布图上我们可以看到：在Chr4和Chr9上分别存在1个显著效应区域，另外在X染色体也存在一个显著效应区域，这也证实了宿主基因突变对微生物的调控影响存在性别区分。
而下方的两个图则是基因型影响显著性P<0.01的详细结果展示：Chr4上X109（P=0.0013）和Chr9上X156（P=0.0060），不同基因型与未加权PCoA5的丰度关系，可以看到有明显的变化趋势。
＊各微生物QTL结果汇总
Fig.6汇总了各菌群的QTL定位分析结果，由此可以发现一些与肠道微生物调控相关的”热点区域”：Chr1、Chr2和Chr3出现频数高，且不同菌群的定位区域重合度很高；相同的情况也出现在性染色体（Chr19）上。
那这个QTL区域是否取决于个体的感染情况呢，于是作者将感染组和未感染组分别进行了分析，发现了许多”热点位置”仅与未感染组的微生物丰度差异有关，而与感染组的微生物丰度无差异没有明显的相关性；同时也发现了一些仅在感染组中发现的宿主QTL结果，但由于感染组的个体更少一些，我们对这一结果的鉴定力度也会更弱。经过这样的分析作者也发现，在这样的分析中会遗漏一些与绦虫感染相关的QTL区域。例如在对全部个体与放线菌的QTL分析中，在Chr3上得到了一个显著相关区域，但实际上仅在未感染组中存在明显差异，由于感染组的个体数更少，在忽略感染情况的分析中，这一部分的遗传效应被淹没了。
STEP5：让手里的锤成为有力的实锤
经过了这么多分析，知道自己手握实锤的作者如何让这一锤在整个研究领域发挥出应有的实力呢？那就是充分的讨论！
首先，目前对宿主-寄生虫-微生物互作研究的很多文献中都提到了寄生虫感染会引起对脊椎动物的肠道微生物结构变化（甩上文献）。那么经过我们的实验研究，则带来了一个重要的反转性结论：寄生虫感染引起的微生物结果变化的量级和方向，则取决于宿主的性别和常染色体基因型。在对2个新分离种群的F2群体的研究中发现，常染色体区域可以同时调控微生物群落结构和微生物对寄生虫感染的响应。这意味着一个物种(宿主)的基因变异改变了另一个物种(寄生虫)对第三方(微生物群落)的生态效应。这一结论是否在其他宿主物种中也有发生，需要进一步的研究，但是（甩上文献）已有研究表明性别x饮食对棘鱼肠道微生物的影响已经在其他宿主（包括人）中得到了广泛的验证。
【反转如此突然，突然没想到吧，虽然还没有进行扩大研究，但是大概率在其他宿主中也能发现这个结论呢】
如果我们的结果在更多的类群中得以验证，这对生物学家们来说可能是一个坏消息，如果不对宿主基因型和性别进行研究的话，他们将无法有效的汇总寄生虫对微生物产生的影响。但同时对宿主基因突变的研究，则很有可能帮助研究者们阐明寄生虫-微生物影响机制，或者微生物对寄生虫抵抗的机制研究。因为研究宿主基因突变可以更好的阐述，为什么不同个体的肠道微生物对寄生虫感染的响应并不一样。
【虽然这会提升了大家研究方案的设计难度，但是这一发现对整个领域的研究还是有好处的】
迄今为止，许多研究已经评估了寄生虫感染对动物肠道菌群的影响（继续甩文献）。然而很大程度上，仍然不确定这些寄生虫效应是否取决于其他生物变量(比如环境影响或宿主基因型)。在我们的研究中则可以给出这个互作情况：宿主基因型（性染色体和常染色体）和寄生虫的感染会协同影响肠道微生物。在本文的结果中可以看到，有1/3的微生物（目水平）对宿主基因型+感染有明显的互作反应，而仅考虑感染的话这一比例只有7%。比如有些微生物在未感染时在雄鱼和雌鱼之间有明显丰度差异，而感染后则没有什么区别。判别分析的结果也表明，在肠道微生物对寄生虫感染的敏感性上，雌鱼比雄鱼更敏感。这一性别决定的影响效应与其他棘鱼研究也是一致的（再次甩出文献）。
【看，性别影响可不是我这个研究的个例哦，这个结论还是相当可信的】
前有研究表明常染体基因型会影响肠道微生物结构，也能够调控肠道微生物对肠道感染的应答，并且也已经在很多其他脊椎动物的研究中发现了宿主对微生物群组成的遗传控制作用（文献不怕多）。在此基础上，我们的研究增加了一个结论：宿主基因型也能够调控肠道微生物对第三方物种的响应。我们对常染体突变效应进行了QTL粗定位分析所发现的基因组区域中，没有发现先前研究中提到与棘鱼肠道微生物自然变异有关的MHCIIb基因（这个基因的作用我可不是瞎说的，有文献的）。
【这说明我的研究结论里实打实就是宿主基因型的影响，没有MHCIIb基因什么事】
虽然我们还没有能够精细定位到候选基因的方法，但是在我们的研究结果中有一些很有意思的可能性：1）在Chr2上QTL区可以影响多个目水平菌群，其中包含转录因子c-MAF。有研究表明，该转录因子可以增强Th2细胞中的白介素IL-4的表达，从而削弱Th1的分化。近期也有报道c-MAF依赖性的T细胞调节宿主对肠道菌群的免疫耐受性。【巧了么不是】同时，这个QTL区还包含内质网钙结合蛋白和突触结构蛋白IX基因，这些基因又与钙离子结合相关，可以影响肠道菌群结构。2）Chr3上的QTL区域则与钙黏素有关，钙黏素则在维持肠道内稳态和屏障功能方面有非常重要的作用。但这些可能的候选基因还是推测出来的，所以未来需要大量的工作进行精细定位分析，来获取候选基因，并通过实验验证它们对绦虫-微生物相互作用的可能影响。
【虽然有文献结论的结合推测，但是目前没有明确候选基因确实是比较大的一个问题，后续继续研究还是需要的】
宿主基因型与感染情况之间，很可能是因为宿主对绦虫感染的免疫响应基因上的突变引起的。寄生虫的出现可能会干扰TLR基因或其下游信号通路，可能会对肠道微生物带来一定的影响。适应性免疫反应可能也掺了一脚：寄生虫感染会触发Th2的响应，增加粘液的分泌和上皮细胞的更新迭代，从而改变黏膜微生物。与这个调控过程有关的任何一个基因发生多态性变异，都有可能增强或减弱宿主对寄生虫感染的免疫反应，也就调控了寄生虫对肠道微生物的影响。同样的，这也可以解释不同性别的宿主的免疫差异（文献怎么能少呢）。
【根据查阅的文献，我们来推测一下可能的调控机制是什么吧】
在我们研究的案例中，寄生虫对肠道微生物的影响，极大可能就是通过宿主免疫系统这种非直接作用发生的，而不是直接的寄生虫-微生物的作用。这是因为裂头绦虫是一种腹腔寄生生物，也就是说在喂养接触棘鱼后，裂头绦虫会进入腹腔而并不会直接与肠道微生物接触。之前就有研究表明棘鱼个体在绦虫探查、有效免疫反应增加和绦虫免疫抑制的敏感性方面有极大的差异。这些免疫响应的多样性，很有可能也增加对微生物的附加影响。原则上讲，尽管寄生虫在物理上是分离的，但它分泌的化合物仍然有可能从腹膜扩散到肠腔从而直接影响微生物菌群。然而，这样的直接影响不太可能被宿主基因型调节，所以如果存在这样的直接作用，在我们的结果中应该显示为是否感染的统计结果应该是主要影响，而现在得到的结论是基因型的影响作用是主要因素。这一点结合之前广泛的研究均证实了绦虫对宿主免疫反应的调控作用，让我们基本可以排除直接作用的可能性。
【这个实锤跑不了吧】
虽然在我们实验1的结果中说明肠道微生物的变化更多取决于是否接触绦虫而与感染结果无关。而且显而易见的，（在喂养过程中）短暂出现在棘鱼肠腔中的绦虫所产生的影响超过了是否在腹腔寄生而引发的微弱影响（在实验2中能够有比较有力的研究）。如果这一点短暂的接触会对肠道微生物造成这么大的影响的话，那么对于野外微生物研究而言将是难上加难。因为我们几乎不可能知道野生动物的感染史，幽灵一样的感染失败也可能对野生个体造成实质上的无迹可寻的差异。然而正如我们后来在实验2中揭示的，即使感染成功的个体之间也存在肠道微生物的差异。
【好吧，确实在实验设计上有一点点没有排除的影响因素，而且我们在之后的实验中的结果更能让人接受】
目前我们还不清楚在我们的研究结果中的这些微生物改变，会造成什么影响。有一些实验研究结果可以参考。比如在小鼠感染研究中，肠道菌群的变化导致了宿主所需要的菌群代谢物的减少。相反也有研究表明寄生虫感染也有可能是有益的，比如减少幽门螺旋杆菌引发的胃部病变风险。而我们的结论则表明，这些由于寄生虫-微生物互作引起的或好或坏的影响，都可以看作是取决于宿主自身的特定性别或基因型。
【在缺乏其他组学资料和验证数据的情况下，我们还需要更进一步的深入研究。但是可以推测，在对更广泛的现象进行研究的时候，我们的结果也是很值得参考的】
靠谱er点评：
常规的微生物研究，或者常规的遗传群体研究我们都见过不少，但这篇文章却实打实地让人眼前一亮。这里最让人感到新意的，是这样一个问题：为什么【微生物】可以作为一个性状来和基因组进行关联？
微生物的丰度是一个体外指征，或者说环境指征，而基因组是生物的生理基础，影响生物的生理指征。我们通常会对生理指征和环境指征的相互影响进行探究，但却很少触及基因组变化对环境指征的影响。而本文将群体遗传和微生物进行了连接，将微生物的丰度看成了生物体的一个性状，这是从生物体到环境跨出的一大步，研究将基因组影响的范围，从一个生物体本身，拓宽到了与生物体相关联的一个系统。
对于一篇ISME文章来说，这仅仅是一小步，是系统工作中的一环；但对于科学研究来说，这却是一大步，因为基因型并不仅能决定生物的表型，更进一步，还能够影响到生物体能在生态系统中与环境达到怎样的平衡，或者说，这也是一种【表型】？这一层思路的打通，就好像”一桥飞架南北，天堑变通途”，让两个看似毫无关联的领域产生了联系。