分子剪刀：基因编辑文章解读（一）—基因编辑利器CRISPR在分子检测领域的应用
2020年2月14日，CRISPR领域大神华人科学家张锋公布了一份关于使用CRISPR诊断工具检测新型冠状病毒COVID-19的protocol，介绍了对标本进行提取、检测的方案，同时列出了靶向病毒基因的向导RNA和扩增引物序列，不过作者表示该方法不能用于临床诊断，因为他们没能获得真实的患者样本来对检测方法进行验证。
CRISPR如何进行分子诊断？下面我们通过张锋团队近年发表的文章来管窥这把“分子魔剪”在检测领域的威力。
CRISPR-Dx技术——SHERLOCK
2017年，张锋团队在Science上发表文章《Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2》，报道了一种基于CRISPR的分子检测技术。CRISPR向导RNA能通过碱基互补配对识别靶标RNA，效应蛋白Cas13a（先前被称为C2c2）在这个过程中被激活了RNase活性，产生“附带效应”（‘collateral effect’），即能够非特异地切割附近的RNA。张锋实验室利用Cas13a的这种特性，结合等温扩增技术，开发了一套基于CRISPR的快速诊断技术（CRSPR-Dx），能够针对attomolar级别、单碱基错配的DNA或RNA分子进行检测。他们还为这一检测技术赋予神探‘SHERLOCK’的名字，即Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，用于寨卡病毒、登革热病毒的检测，意图以夏洛克·福尔摩斯般细致入微的检验和精确严密的考察让病毒无所遁形。另外，可能是考虑到上述病毒疫情地区的医疗卫生条件，SHERLOCK相关的试剂还可以被冻干，无需冷链条件并能够长期保存，应用时在纸片上便能恢复试剂活性。
不同于其他Cas蛋白，Cas13a的靶标是RNA。CRISPR RNA（crRNA）通过碱基互补配对识别靶标ssRNA，随后Cas13a被激活了RNase活性，能够切割附近的非靶标RNA。作者先使用Leptotrichia wadei细菌中分离出来的Cas13a，与crRNA、一段带有荧光报告集团和淬灭基团的报告ssRNA（类似TaqMan探针）以及靶标RNA共同进行孵育然后检测荧光信号，其检测灵敏度能够达到约50fM。然后，他们预先将靶标dsDNA或RNA进行一轮重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA or RT-RPA），然后通过T7体外转录将扩增的DNA转换成RNA，再使用Cas13a-crRNA进行检测（即完整的SHERLOCK方法，图1和图2），结果不管靶标是DNA或是RNA，检测灵敏度均达到单分子的水平。相比单独的Cas13a，SHERLOCK能够检测浓度低至2aM的靶标RNA，而对于靶标DNA，SHERLOCK的灵敏度则甚至达到了0.1aM（图3）。
图1
图2
图3
初步试验获得成功后，研究转入“实战”，作者构建了包含寨卡病毒或登革热病毒的慢病毒载体，以检验SHERLOCK对有高灵敏度要求的感染性疾病检测是否有效。病毒经热裂解（95℃，2min）后进行RPA（37℃，20min），并通过T7体外转录生成待检测模板，实验结果显示SHERLOCK能够检测到浓度2aM的病毒颗粒，并很好地区分寨卡和登革热两种不同的病毒（图4）。
图4
同时，作者还测试了冻干在纸片上的SHERLOCK试剂的检测性能，尽管冻干的SHERLOCK试剂检测的荧光信号有轻微下降，但总体上，对靶标ssRNA的检测灵敏度仍能保持与液态试剂相当，对浓度20aM的模拟寨卡病毒，冻干的SHERLOCK试剂可以轻易检出（图5）。
图5
SHERLOCK还可以直接检测临床样本（血清、尿液、唾液）中的寨卡病毒（浓度可能低至2×103 copies/mL，3.2aM）；而提取病患的血清或尿液标本中的RNA后 ，再将其逆转录为cDNA进行检测，灵敏度可以进一步达到1.25×103 copies/mL（2.1aM，经qPCR验证，图6）。
图6
CRISPR分子检测另外一项重要的应用是病原微生物的鉴定和特定细菌基因的检测。作者选择了16S rRNA基因的V3区域作为靶标，在其旁侧的保守区域中设计了用于RPA的引物。使用一个靶向5种不同致病菌株V3区域的panel分别对大肠杆菌（E.coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的基因组DNA进行检测，结果表明SHERLOCK能够准确鉴定菌株，同时panel中的5类crRNA展示出低交叉反应的特性（图7，Ec：大肠杆菌；Kp：肺炎杆菌；Pa：铜绿假单胞菌；Mt：结核分枝杆菌；Sa：金黄色葡萄球菌）。
图7
接下来作者又探究了SHERLOCK分子检测的特异性情况，他们分别针对寨卡病毒的2种不同病毒株（African strain，American strain）设计了靶向crRNA，并且在SNP（African strain为U，American strain为C）邻近引入错配碱基，用以验证SHERLOCK对靶标序列错配的容忍度。几类crRNA都能显著特异地检测到对应的病毒株，也表明SHERLOCK对单碱基突变的靶标序列仍然具有很好的识别检测能力（图8）。
图8
在另外一组针对登革热病毒的2种不同病毒株（strain1，strain3）的错配检测中，SHERLOCK同样展现出极好的检测特异性（图9）。
图9
藉由强大的单碱基识别能力，SHERLOCK又剑指人类基因检测领域。作者选择了散布在人类基因组上的5个健康相关的SNP位点，使用23andMe的基因组数据作为金标准进行比较。他们收集了4人份的唾液样品并使用过柱纯化的方式提取了基因组DNA，然后使用SHERLOCK对这5个SNP进行检测；另外一组实验中，研究人员甚至不提取基因组DNA，而将唾液样品高温孵育（95℃，5min）然后直接使用SHERLOCK检测。在2组不同的提取方式实验中，无论是纯合还是杂合SNP位点，SHERLOCK都能显著特异地进行识别（图10）。
图10
最后，这套CRISPR-Dx工具终于来到了肿瘤液态活检领域，作者也坦言检测游离DNA中的低频肿瘤突变是极具挑战性的工作。他们选择了2个人类肿瘤基因热点突变EGFR L858R，BRAF V600E，在实验室中模拟了0%，0.1%，1%和5%几种不同突变频率梯度。cfDNA在RPA后，分别使用对应正常基因型（wild-type）和肿瘤突变（mutant）的crRNA进行检测。结果表明，SHERLOCK可以区分正常基因型和热点突变，针对这2种人类肿瘤基因热点突变的检测均能达到0.1%的灵敏度（图11）。
图11
在文章的最后，作者总结了SHERLOCK在未来潜在的应用方向：第一个是取代传统的qPCR（如TaqMan法）进行RNA或DNA的定量；第二是应用于多类RNA表达丰度的快速检测，第三则是用于其他一些需要高灵敏度的检测，如核酸污染的检测。另外作者还表示SHERLOCK也有监测活体细胞中特定转录本或疾病相关突变的潜能。同时，SHERLOCK试剂纸片使用后可以在短时间内回收处理后重新使用，并仍能保持稳定的特异性和灵敏度，这使其检测费用低至每份检测0.61美元。SHERLOCK的这些优势彰显了CRISPR在分子检测领域的广阔应用前景，也开启了快速、稳健和高灵敏的分子检测技术新纪元。
SHERLOCKv2
SHERLOCK虽然有高灵敏、单碱基分辨率及便携式等优点，但也存在一些局限，如单个反应只能检测一种靶标分子、无法进行定量检测，以及仍然依赖荧光检测仪器报告结果。2018年张锋团队再次在Science上发文，文章题目为《Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6》，推出了升级版SHERLOCKv2（SHERLOCK version2），SHERLOCK的升级包括4个方面：
1.单反应可使用4种荧光以检测多个靶标分子；
2.针对低至2 attomolar投入量的定量方法；
3.整合一种CRISPR相关的辅酶Csm6，检测信号强度提高3.5倍；
4.使用横向流动读出试纸进行检测，无需额外的检测仪器
这篇文章也针对这4个改进方向进行了分类叙述：
在检测通量方面，为实现单个反应检测多种靶标分子，作者考虑根据Cas酶的序列剪切偏好性来组合一套多通道综合的检测工具，他们筛选了Cas13a家族的3种蛋白和Cas13b家族的14种蛋白，用各种不同的homopolymer（长度5nt）检测各类Cas蛋白偏好剪切的碱基；同时他们还对反应buffer的pH值、盐离子浓度、金属离子类型、crRNA的靶标位置和长度做了大量的摸索实验，确定了最优的条件。研究人员通过观察各类Cas蛋白对2个核苷酸单元（dinucleotide motifs）的“附带效应”来评估其序列剪切偏好性，最终他们确定了4种能够分别独立识别并剪切AU，UC，AC和GA的Cas蛋白（LwaCas13a，CcaCas13b，LbaCas13a和PsmCas13b，分别来自不同的细菌；另外作者还设计了许多6nt的寡聚RNA用于筛选Cas蛋白，暗示未来可以进一步开发出更多的Cas蛋白组合来同时检测更多的靶标分子，图12）。
研究人员还整合了一种能够识别dsDNA的Cas蛋白AsCas12a（也称BV3L6），AsCas12a也有类似的“附带效应”在识别靶标dsDNA后可以切割附近的ssDNA。在一组检测能力的比较实验中，相比Cas13a，单独的AsCas12a只能检测浓度10nM以上的靶标分子（图12D，虚线），而搭配RPA后，AsCas12a能实现浓度低至2aM的单分子检测。
图12
接下来研究人员将LwaCas13a，PsmCas13b，CcaCas13b和AsCas12a组合到一起，对应搭配FAM，TEX，Cy5和HEX4种不同的荧光报告基团修饰的crRNA，形成一套多靶向的检测工具，同时检测多种靶标分子（合成的dsDNA和ssRNA，寨卡病毒ssRNA和登革热病毒ssRNA），结果表明SHERLOCKv2能够同时识别所有靶标，也可以应对各种靶标分子的不同组合方式，显示出优异的特异性（图13）。
图13
多靶向的SHERLOCK是否仍能保持相应的检测灵敏度？作者做了以下的工作：他们选择了2种细菌的基因（绿脓杆菌的脂酰基转移酶基因和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因），使用搭配了RPA的SHERLOCKv2进行检测，结果表明SHERLOCKv2的检测灵敏度可以达到attomolar级别。类似的，在模拟的寨卡病毒和登革热病毒混合样品中，SHERLOCKv2同样能够实现attomolar级别的检测（图14）。基于Cas蛋白碱基剪切偏好性组合起来的这套多通道SHERLOCKv2提高了检测规模，同时也降低了检测费用。
图14
在解决SHERLOCK的定量检测问题上，作者发现SHERLOCK依赖的预扩增过程容易很快达到反应饱和而导致整个扩增反应非线性，使其无法准确进行定量，于是他们尝试将扩增引物浓度降低，经过引物浓度梯度的测试后，作者确定了反应体系中引物终浓度为240nM时，检测的信号值和靶标投入量有最佳的线性关系，并且在靶标分子浓度低至attomolar级别时这种线性关系仍能保持（图15）。另外，考虑到很多核酸检测领域可能要求单分子每毫升的灵敏度（如HIV的检测），作者通过增加RPA的反应步数，将灵敏度提高到一个新的水平。其中LwaCas13a能检测浓度为200，80，甚至8zM的样品（投入体积可以容许250和540μL），而PsmCas13b则能在250μL反应体系中检测200zM的样品（zM这个单位实在很罕见，不知道这个量级下作者的实验室究竟是如何规避核酸污染的）。
图15
为增强SHERLOCKv2的检测信号，作者联想到了CRISPR typeIII的效应核酸酶Csm6，这种蛋白能被环状的A或末端带有2′,3′环化磷酸基团的线性polyA激活，而LwaCas13a和PsmCas13b切割RNA后正好能产生5′羟基和2′,3′环化磷酸基末端，这提示了Csm6可以搭配Cas协助放大SHERLOCK的检测信号。他们测试了不同长度的RNA polyA和3′末端的修饰类型，发现EiCsm6（来自意大利肠球菌）和LsCsm6（来自唾液乳杆菌）能够被带2′,3′环化磷酸基末端的A6（6个A碱基）RNA活化，同时他们也发现EiCsm6，LsCsm6和TtCsm6（来自嗜热栖热菌）都偏好切割富含A或C的RNA，这使得Csm6和LwaCas13a（偏好切割UU和AU）的搭配成为可能（图16D）。于是作者将Csm6与LwaCas13a进行组合，并设计了几段polyA+polyU的激活RNA以测试信号增强的情况，因为LwaCas13a偏好切割UU和AU的2核苷酸单元，其切割RNA后可以产生激活Csm6的polyA，结果他们发现A6-U5的序列能激活EiCsm6和LsCsm6（与前面6个A碱基活化Csm6的结论吻合，结果经质谱验证，图16E）。
作者将Csm6和LwaCas13a各自的报告ssRNA混合（polyA和PolyU）并带上相同的荧光集团，并加入激活RNA A6-U5，对登革热病毒ssRNA进行检测，他们发现提高激活RNA A6-U5和Csm6的报告ssRNA的浓度能够增强Csm6的作用，使检测信号获得明显提升（图16F）。经过优化，Csm6和LwaCas13a的组合在脂酰基转移酶基因的检测中，反应效率和检测信号相比单独的LwaCas13a都得到极大的提高和增强（图16G）。
图16
SHERLOCKv2还改进了检测的可视化，即无需额外的专业检测仪器便可判断检测结果。作者基于商用的横向流动试纸条设计了一种检测试纸（图17A），在样品结合区使用结FAM抗体的金纳米粒子来结合报告ssRNA，质控带固定了链霉亲和素，检测带则使用了Protein A以捕获FAM抗体。对于报告ssRNA，使用FAM荧光集团和生物素分别标记其两端。当检测结果为阴性时，报告ssRNA未被Cas蛋白切割而保持完整，ssRNA上的生物素与质控带上的链霉亲和素结合使其在质控带上积累显色，检测带不能显色；而当检测结果为阳性时，ssRNA被Cas蛋白切割为带FAM标记和带生物素标记的两部分，因而在试纸层析时质控带和检测带均能积累显色。这一设计不需要大型检测仪器，在 90分钟内便能完成对寨卡病毒和登革热病毒ssRNA的检测，灵敏度可以达到2aM（图17B，C）。另外，研究人员还使用了快速粗提（<10分钟，无纯化步骤）的方法提取了人类唾液样品的DNA，将样品直接投入SHERLOCKv2的检测体系中，经23分钟内的反应和2小时的横向流动试纸读数，能准确获知样品的SNP分型，这使得整个检测流程变得十分简单快捷。
图17
升级的SHERLOCKv2继续挑战肿瘤液态活检（图17D）：作者设计了靶向EGFR L858R和19号外显子缺失热点突变的SHERLOCK检测工具，收集了健康人和非小细胞肺癌患者的游离DNA（分型经NGS靶向测序验证）并使用SHERLOCK进行检测，结果无论是基于荧光信号检测还是横向流动试纸读出，SHERLOCK均能识别这2种突变（图18E-J）。研究人员最后选择了Csm6、Cas13a搭配一段长AC的报告ssRNA，结合RPA在横向流动试纸上应用，使检测更为快速，同时也使背景信号更低，从而降低了假阳性率（图18K，L）。
图18
在2017年，张锋团队曾经在Science上报道了利用PspCas13b建立的一套RNA碱基编辑系统REPAIR，用以修复潜在的基因组疾病相关突变，Cas13蛋白家族经过团队的开发如今既能发挥治疗的作用，又能扮演伴随诊断工具的角色。团队也意将2套系统结合起来，通过SHERLOCKv2的基因分型检测提示REPAIR进行碱基编辑治疗，也能对经REPAIR编辑的RNA进行检测以监控碱基编辑的效率（图19A）。初期试验结果也取得了突破，团队构建了一种家族性性腺瘤息肉症APC基因突变（c.1262G>A）HEK 293FT细胞系，使用PsmCas13b和LwaCas13a分别靶向健康型和突变型RNA进行检测，同时他们利用REPAIR系统对细胞APC基因突变进行碱基编辑修复，然后通过NGS确认了REPAIR的编辑效率为43%，这些碱基编辑的结果随后也能被SHERLOCKv2检测到（图19B-F）。
最后，作者总结了SHERLOCKv2的广阔应用前景，包括药物基因组学治疗发展应用领域的基因分型检测、机体基因修饰改变的检测、病原体的检测等，其简单、快速、便携等优势使某些缺乏电力供应的场所或室外的应用成为可能。未来，团队将考虑在试纸上增加检测带以实现单次检测多个靶标，以及基于液相的检测色谱读出。升级的CRISPR-Dx使生物技术研究和健康检查等应用领域中的核酸检测变得更为容易，而SHERLOCK也已为进一步部署应用做好了准备。
2019年，张锋团队还在Nature Protocols发表方法学文章《SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases》，详细介绍了如何构建SHERLOCK体系进行靶标检测的方法，同时也为读者指导了如何设计高效的crRNA和等温扩增引物、阐述了多靶标检测和定量检测的重要考量因素，为科研工作者利用SHERLOCK工具进行临床诊断和生物技术研究提供了详实的方法和经验。
2018年4月27日，SHERLOCKv2在Science发表的同日，包括SHERLOCKv2在内，Science其实连发了4篇关于CRISPR技术的文章，阐述CRISPR在临床诊断的应用，张锋团队贡献了其中2篇，而CRISPR领域的另外一大山头，来自美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna团队也介绍了一种基于Cas12a的病毒分子诊断技术（DETECTR），这部分内容将在下次的文献解读中进行介绍。
两大山头的专利之争尘埃未落，对病毒的检测也仍缺乏临床样本的验证，CRISPR-Dx在国内未必有应用的土壤。如今疫情扩散到全球，美国成为“震中”，不知是否能推进检测技术更广泛的应用和进一步的升级迭代。不过毫无疑问的是，科学定能拯救世界。
参考文献
1.Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438–442. doi:10.1126/science.aam9321
2.Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439–444. doi:10.1126/science.aaq0179
3.Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 2017;358(6366):1019–1027. doi:10.1126/science.aaq0180
4.Kellner, M.J., Koob, J.G., Gootenberg, J.S. et al. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc 14, 2986–3012 (2019). https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2
文献分享 | miRNA+CRISPR系统=细胞特异性基因编辑工具