NG详解：现代玉米育种过程中的“育种选择指纹”

玉米(Zea mays.L)是目前世界上种植面积最大的农作物，可用作粮食、饲料和工业原材料。玉米起源于北美洲墨西哥南部的一个盆地，经人为高度选择改良后，现可广泛种植于亚、欧、美州大陆。在20世纪初，G.H.Shull报道玉米具有自交衰退和杂种优势现象，E.M.East开始进行自交系选育，D.F.Jones建议使用双交种进行杂交玉米种子生产，使得商业杂交玉米品种在20世纪30年代问世。玉米是杂种优势利用最成功的作物之一，由于其杂交种具有非常强的产量杂种优势，因此在全世界范围内目前种植的玉米有超过90%都是杂交种。在诸多育种家的努力之下，自20世纪30年代问世以来，玉米商业杂交种的单产发生线性成倍增长（以美国为例，玉米单产提升了近8倍，图1）。这不可思议的单产增长主要归咎于两方面努力：玉米耐高密度品种的选育和高密度种植措施的采用。据研究统计，在美国衣阿华州，玉米种植密度从1930年的30000株/公顷提升到2000年的75000株/公顷左右(Duvick, 2004)。为提高玉米杂交种的耐密性，育种家逐步对自交系进行遗传改良：(1)看得见的改良——株型改良，使得杂交种能够克服高密度种植带来的遮荫问题；(2) 看不见的改良——生理改良，提高生物和非生物胁迫抗性，使得杂交种能够克服高密度种植条件带来的病虫害高发、干旱胁迫和肥料营养供应不足等问题。然而，目前尚不清楚在这两种改良的背后，育种家通过什么样的方式，对哪些位点进行选择从而提高了玉米的耐密性。

近日，中国农业科学院生物技术所与华南农业大学王海洋组和北京大学生命科学学院/现代农学院邓兴旺/何航研究组合作，在国际学术期刊Nature Genetics《自然•遗传》上发表题为“Genome-wide selection and genetic improvement during modern maize breeding”的文章。该研究对350份收集自中国和美国各个玉米育种时期常用自交系进行基因组分析，从全基因组范围内系统解析现代育种过程中玉米的表型、基因组变化和育种受选择位点的遗传规律，这对于探究育种家在近代育种过程中通过什么样的方式对哪些位点进行选择而提高玉米的耐密性具有重要的意义。

图1. 1930年至2010年美国杂交玉米单产变化(Duvick, 2004)

该研究收集近几十年来国内外各个育种时期广泛使用的350份玉米自交系为材料(图2a)：其中美国自交系163个， 中国自交系187个。美国自交系包括74个早期育成的公共自交系（Public US自交系，育成年代在1950s-1980s之间）和89个过保自交系(expired Plant Variety Protection Act Certificates，Ex-PVP自交系，绝大多数2003年后育成)。中国自交系包括30个早期自交系（育成年代1960-1979）、95个中期自交系（育成年代1980-2000）和53个当今自交系（育成年代2000-至今）。通过对各个品种进行深度测序（平均13.4×）共获得2500万个左右的高质量变异，基于这些变异可将这些材料划分成典型的4个群：SS、NSS、IDT和HZS群，外加一个混合群（以上4个群中单个群基因组比例不超过60%）。在育种过程中伴随着非常明显的群体结构变化：(1) 美国种质在后期IDT和种质逐渐增多；(2) 中国自交系随着育种进展HZS种质逐渐减少，同样出现少量IDT种质。在基因组水平上，中美自交系都呈现出育种特征：(1) LD衰减到固定值时的距离增加；(2) 整体多样性下降；(3) 不同年代材料之间出现中等程度分化。

图2. 现代育种过程中玉米自交系株型改良. (a) 该研究材料组成；(b-d) 叶夹脚(b)、雄穗分支数(d)和穗位高(e)伴随育种过程中的变化. (e) 不同育种时期骨干自交系雄穗分支数和叶夹脚大小。

为探究“看得见”的表型在育种过程中的变化，即株型改良，该研究通过两个年份四个环境考察15个株型表型，发现无论在中国和美国现代玉米育种过程中，晚期材料相对于早期材料，都出现穗位高度降低、雄穗分枝数减少、叶夹角更紧凑以及花期提前的表型收敛现象，说明不同地区玉米自交系耐密度株型具有相同特征，且改良的方向一致（图2）。将基因组变异与这15个农艺性状表型数据结合进行全基因组关联分析 (GWAS)共定位到233个显著QTLs。利用非同义SNP、候选基因关联分析和表达分析等手段，该研究鉴定到多个高可信度的候选基因。例如，ZmNAC16与ZmSPB18与叶片夹角显著关联、ZmREV1(MYB转录因子)与开花时间显著关联、ZmCRF4 (与拟兰芥细胞分裂素响应基因CRF4 同源)和ZmARR2 (与拟兰芥细胞分裂素响应基因ARR2 同源)与雄穗分支数显著关联等。穗位高、叶片夹脚、雄穗分枝数和花期等四个改良性状的大多数QTL位点有利等位基因频率在中国和美国育种过程中都显著提升，伴随着50%左右的位点在中美育种过程中有利等位基因频率同时提高，说明针对多位点的选择改良了这些性状,且中美育种改良的位点大多数均一致，但对单个位点选择的力度不同。该结论同样受到多基因风险值分析的支持。为验证这部分鉴定潜在受选择位点的可靠性，该研究还利用CRISPR技术敲除其中一个候选基因THS4 (图3)。该基因编码一种SPL蛋白，在其启动子区域有插入-缺失多态性(InDEL)与雄穗分支数显著关联，且CRISPR敲除突变体出现显著减少的表型。结合先前研究报道RA2基因在调控雄穗分支数中起非常重要作用，该研究分析RA2 对THS4 基因的启动子结合情况，发现不同启动子区域插入-缺失多态性。

图3.对TSH4基因进行功能验证。(i) 该基因位点上的关联分析信号鉴定到多个插入缺失变异(InDel)与性状显著关联；(j) 用于酵母单杂的Tsh4启动子序列；(k) 该酵母单杂表明RA2蛋白与Tsh4 不同基因型启动子序列结合能力差异显著；(l) RA2 与Ths4不同基因型启动子驱动的LUC报告基因结合能力存在差异；(m) Tsh4不同启动子基因型对应的雄穗分支数；(n) Tsh4不同启动子基因型在育种过程中的变化。

与RA2蛋白结合能力有明显差异，推测该基因可能是RA2的下游基因，其作用机制是通过受RA2调控而改变雄穗分支数。

为探究“看不见”的育种改良的遗传基础，该研究利用XP-CLR以及π ratio的方法，对不同时期材料进行比较鉴定全基因组受选择区间，该分析获得1888个在潜在的受选择区间。这些期间与之鉴定的受选择区间不一致，说明玉米现代育种选择基因与驯化和早期改良所选择的基因差别较大。有304个区间在中国和美国自交系都受选择，98个区间在中国持续受选择，说明将近20%的区间在不同地域/不同时期都受到选择，但在不同地域/不同时期具有明显的地域/时期选择偏好性。GO功能富集分析发现，受选择基因富集生物和非生物胁迫响应基因、光信号转导基因以及植物激素响应基因。非同义突变分析发现将近有40%的受选择候选基因带有非同义突变，且非同义突变往往在育种过程中频率发生显著变化。为验证该方法有效性，作者利用CRISPR技术对受选择候选基因ZmPIF3.3进行功能验证(图5)。该基因可能与穗位高有关，CRISPR突变体呈现出株高和穗位高都变低的表型，说明该基因确实是该位点的受选择基因。这些结果说明现代育种过程中确实在选择生物和非生物胁迫抗性相关基因，同时激素相关基因和光信号转导基因也是现代育种选择的靶标。

图4. 美国(最上图)和中国(下三图)受选择区间及受选择基因。

图4. 对受选择基因ZmPIF3.3的验证. (a) 该基因附近的受选择信号; (b) 该基因序列上非同义变异；(c) 该基因非同义突变构建的单倍型对应表型变化；(d) 该基因非同义突变构建的单倍型频率变化；(e) CRISPR-cas9敲除系统构建；(f) 敲除突变体和野生型的表型；(g-h) 敲除突变体和野生型的株高和穗位高变化。

该研究的意义在于：

首次在作物上揭示现代育种过程中全基因组范围内遗传改良的特点，证明玉米现代育种过程中确实存在生物胁迫/非生物胁迫基因选择；同时挖掘到一大批高可信度的受选择基因，为进一步挖掘和克隆玉米重要受选择基因，了解玉米耐密性调控的遗传机制提供了良好的数据基础。该研究还实际展示了通过取样不同年代主流育种材料进行基因组分析能够找到可靠的育种受选择基因，对其它育种开展现代育种过程中重要受选择基因挖掘具有非常重要的借鉴意义。

该解读由本文第一作者林泽川博士执笔

林泽川博士简介2010-2013中国农业科学院 硕士，2014-2019 北京大学 前沿交叉学科研究院/生命科学联合中心博士。在读博期间，主要从事基于基因组学/多组学整合的水稻和玉米的群体遗传研究，曾获全国植物基因组学大会报告一等奖、北京大学“三好学生”“优秀科研奖”等奖项，以第一作者/共同第一作者在Nature genetics、 PNAS以及Plant biotechnology journal等杂志发表论文5篇，累积影响因子达46。

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参考文献：

1. 1.      East, E.M. (1936). Heterosis. Genetics 21(4), 375.

2. 2.      Duvick, D.N., Smith, J., and Cooper, M. (2004). Long-term selection in a commercial hybrid maize breeding program. Plant Breeding Reviews 24(2), 109-152.

3. 3.      Duvick, D.N. (2005). The contribution of breeding to yield advances in maize (Zea mays L.). Advances in Agronomy 86, 83-145.

4. 4.      Wang BB*, Lin ZC*, Li X*, Zhao YP, Zhao BB, Wu GX, Ma XJ, Wang H, Xie YR, Li QQ, Song GS, Kong DX, Zhi ZG, Hong HB, Shen RX, Wu H, Chen CX, Meng ZD, Wang TY, Li Y, Li XH, Chen YH, Lai JS, Hufford MB, Ross-Ibarra J, He H and Wang HY. (2020) Genome-wide Selection and Genetic Improvement During Modern Maize Breeding. Nature Genetics, https://www.nature.com/articles/s41588-020-0616-3

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41588-020-0616-3

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