用户文章 Plant Journal—Sly-lncRNA15492与Sly-miR482a互作影响番茄对致病疫霉的免疫

该文章由大连理工大学栾雨时课题组完成，博士生姜宁和崔军为共同第一作者，栾雨时教授为通讯作者，课题组长期从事植物分子生物学、基因工程领域的研究工作，在植物非编码RNA、转录因子的发现及功能鉴定方面独树一帜，尤其是以番茄与致病疫霉为材料进行的植物与微生物分子互作研究，结合大量的生物信息学预测、分析以及先进的分子生物学实验技术，取得了众多突破性的成果，发表在植物科学领域的TOP期刊-“Plant Journal” (3篇)、植物科学领域的TOP -“Plant Cell and Environment”、 食品科学领域的TOP 期刊-“Food Chemistry”、农艺学领域的TOP及园艺学领域的TOP期刊-“Theoretical and Applied Genetics”、园艺学领域的TOP期刊-“Horticulture Research”(2篇)等上（大连理工大学团队RNA-seq超级六连发）。

Sly-lncRNA15492 interacts with Sly-miR482a and affects Solanum lycopersicum immunity against Phytophthora infestans

期刊：Plant Journal

影响因子：5.726

发表时间：2020年

发表单位：大连理工大学

技术手段：降解组测序

研究背景

致病疫霉引起的晚疫病是番茄的主要病害之一，了解番茄抗晚疫病的分子机制有助于培育抗晚疫病作物。小RNA可以通过抑制相应的靶基因的来影响植物对病原体侵染的抗性，如miR482/2118家族的成员可以通过调节NBS-LRR类抗性基因（植物抗病基因中最大的一类）来影响植物对病原的抗性。lncRNA是一类长度大于200nt，缺乏蛋白质编码能力的非编码RNA,已有很多研究报道lncRNA在植物对应对病原菌侵染过程中发挥重要作用，作者之前的文章就报道过番茄中lncRNA23468可以通过ceRNA机制来抑制miR482b的表达，促进NBS-LRR类基因的积累进而增强对致病疫霉的抗性。Sly-lncRNA15492是作者之前通过lncRNA测序发现的番茄被致病疫霉侵染前后差异表达的lncRNA，Sly-miR482a是番茄中miRNA482家族成员之一，其前体MIR482a位于Sly-lncRNA15492的反义转录本上。因为lncRNA可以抑制其对应的反义转录本的表达，而miRNA-482又可以通过调节NBS-LRR类基因来调控植物对病原的抗性，因此作者推测Sly-IncRNA15492可能通过和Sly-miR482a互作来影响番茄对晚期疫霉的免疫，并通过一系列的实验来证实其中的分子机制。
技术手段

降解组测序、RLM- 5’RACE、过表达、VIGS、STTM(短串联模拟靶标)、amiRNA(人工合成微RNA)和reverse amiRNA(反向人工合成微RNA)等。
研究结果

作者先构建了Sly-lncRNA15492过表达和沉默的转基因番茄材料并进行叶片致病疫霉侵染实验证实Sly-lncRNA15492可以正向调控番茄对致病疫霉的抗性。
     图1致病疫霉侵染lncRNA15492过表达和沉默的转基因番茄植株叶片的病斑情况
随后通过qRT-PCR发现Sly-miR482a的表达水平在lncRNA15492过表达和沉默材料中分别受到抑制和诱导，进一步实验发现这种负相关的关系是Sly-lncRNA15492通过与位于其反义链上的Pre-Sly-miR482a(miRNA482a的前体)结合来调控的。图2 Pre-Sly-miR482a位于Sly-lnc15492反义链上示意图图3 lncRNA15492过表达和沉默转基因番茄植株中Sly-miR482a的表达水平以及在番茄叶片瞬时表达lncRNA15492情况下lncRNA15492和Sly-miR482a的表达水平在番茄中miRNA482a的过表达和沉默实验（沉默实验分别采用了STTM和反向人工微RNA技术）证实了Sly-miR482a是番茄应对晚期疫霉免疫的负调控因子，进一步结合降解组测序（由联川生物提供），靶基因预测、RLM -5’RACE实验和VIGS实验发现Sly-miR482a主要是通过靶向NBS-LRR1基因来调控番茄应对致病疫霉的免疫图4 致病疫霉侵染miRNA482a过表达和沉默的转基因番茄植株叶片病斑情况图5 致病疫霉侵染NBS-LRR1基因沉默番茄植株叶片的病斑情况另外作者还发现在过表达的miRNA482a的番茄植株中进一步过表达Sly-lncRNA15492可以减弱Sly-miR482a对番茄抗晚疫病的作用。为了进一步探究Sly-lncRNA15492和Sly-miRNA482a的在番茄应对致病疫霉侵染过程中的相互作用模式，作者分析了之前降解组测序数据发现Sly-miRNA482a可以切割Sly-lncRNA15492，并用RLM- 5’RACE实验验证了切割位点的存在。检测发现在Sly-miRNA482a过表达和沉默的转基因番茄植株中的Sly-lncRNA15492的表达量显著低于和高于对应的野生型。将构建的人工合成微RNA amiR482a与lncRNA15492在番茄叶片中共表达发现lncRNA15492的表达会受到Sly-miRNA482a抑制，其表达量会显著低于单独过表达lncRNA15492的叶片，而将lncRNA15492上与Sly-miRNA482a的结合位点突变后再进行上述验则发现lncRNA的表达不会受到Sly-miRNA482a的抑制，作者后续还在烟草叶片中也重复了上述实验进行了验证。图6一系列实验验证Sly-miR482a 可以切割 Sly-lncRNA15492图7 Sly-lncRNA15492 和Sly-miR482a互作调控番茄对致病疫霉抗性的模型
研究结论

通过研究发现Sly-lncRNA15492 和Sly-miR482a分别作为番茄应对致病疫霉免疫的正负调控因子，当前植物中研究lncRNA和miRNA互作大多是从lncRNA可以作为miRNA诱饵的ceRNA机制入手，而作者通过一系列研究提出了一种新的lncRNA和miRNA互作机制和模型解释lncRNA和miRNA互作在番茄应对致病疫霉免疫中的作用，Sly-lncRNA15492可以通过与位于其反义链上的Pre-Sly-miR48a（Sly-miR482a前体）结合来抑制成熟体Sly-miR482a的表达，进而促进抗病基因Sly-NBS-LRR的积累以增强番茄对致病疫霉的抗性，而当Sly-NBS-LRR积累过多时，成熟体的Sly-miR482a会切割Sly-lncRNA15492以解除对Pre-Sly-miR482a的抑制来促进成熟体的Sly-miR482a积累，从而减少Sly-NBS-LRR的积累维持Sly-NBS-LRR的动态平衡。该文章由联川项目经理沈浩宇解读

沈浩宇，负责联川生物吉林省业务，自2016年11月入职联川生物以来，合作项目已成功发表SCI文章30余篇，擅长售前项目方案设计和售后项目数据挖掘。

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