RIP？Co-IP？​Pull-down？这篇千字长文让你明明白白 | RIP专题

01为什么RIP实验前要做WB预实验评估？

做WB预实验主要目的：

• 检测抗体的特异性，是否能结合目的蛋白；严谨一些，需要对目的蛋白条带打质谱鉴定

• 检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平

02销售高频RIP-SEQ的QA问题整理

Q1：提取好的RNA，可以用来做RIP实验吗？

A1：当然不能，因为RIP-Seq是用特异的抗体拉下RNA结合蛋白（RBP），而RBP结合着RNA序列，进而对结合的RNA序列进行测定。提取的总RNA里已经没有RBP了。

Q2：客户要做RIP实验，我该了解哪些售前信息？

A2：客户要做的样本类型？关注的RBP是什么（做RIP实验，客户一定有关注的RBP）？这个RBP是否有IP级别的抗体（应有相关文献支持）？关注的RBP结合的RNA序列类型（比如mRNA，miRNA，lncRNA，circRNA等）？其他客户关注的信息？

Q3：去哪些网站选购RIP实验的抗体？

A3：建议在Sigma-Aldrich（https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/life-science/antibodies.html）、Abcam（https://www.abcam.cn/）和Cell Signaling Technology（https://www.cellsignal.cn/）网站选购IP级别的抗体。推荐参考文献来选择适合的抗体。

Q4：我的抗体做WB都有目的蛋白条带的，为啥做RIP就没条带了？

A4：免疫试验有很多，但实验目的不一样，例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS，其中只有WB是一种需要将蛋白质变性的实验，用强烈的蛋白变性剂SDS和β巯基乙醇，将蛋白质的三维结构全部抹去，这种情况下任何一种该蛋白的抗体都能识别WB实验中变成直线状态的抗原；但能做WB的抗体就不一定能用来做非变性试验IP、IF、IHC了，因为天然蛋白的三维结构隐藏了很多抗体结合位点，WB级别的抗体无法与之结合。做RIP实验，需要选购IP级别的抗体。

03Co-IP简介与应用场景

Co-IP（Co-Immunoprecipitation）原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在XY蛋白复合物，用X（X也称为诱饵蛋白）的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y（Y也称为靶蛋白）也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入X的抗体沉淀蛋白X，随后利用蛋白印迹（WB）检测或质谱鉴定沉淀中是否存在蛋白Y，如果存在，则说明细胞内存在XY蛋白复合物，即蛋白XY存在相互作用。

图 Co-IP实验原理

Co-IP流程

收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE分离蛋白—WB检测是否存在靶蛋白或质谱鉴定靶蛋白。

图 Co-IP实验流程

Co-IP的优点

1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。

2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。

3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

Co-IP的局限性

1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；

3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确， 实验就得不到结果。

Co-IP的应用

1. 测定两种目标蛋白质是否在体内结合

2. 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档

04Pull-down简介与应用场景

Pull-down原理

利用带有标签的已知蛋白X作为诱饵蛋白（最常用的是GST标签，即谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione S-transferase），诱饵蛋白特异性结合谷胱甘肽亲和树脂，当目的蛋白Y溶液过柱时，将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物捕获。复合物洗脱后，通过蛋白凝胶电泳分析两种蛋白XY的相互作用，或者筛选相应的目的蛋白Y。GST-Pull down主要包括以下三个部分：1）利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；2）通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；3）利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。

图 Pull-down实验原理

Pull-down与Co-IP的异同比较

1. Co-IP和Pull-down都是用于检测蛋白相互作用的实验，两者有很多相似之处，如只能检测强相互作用、只能定性分析、不能检测瞬时相互作用等。同时两者在原理及实验操作上也存在一定的区别。

2. Co-IP研究的是体内自然状态下的蛋白质互作，反映的是比较真实的蛋白质之间的相互作用，而Pull-down则是通过体外实验，可以去除其它蛋白的影响，但无法得知体内真实的结合情况。

3. Co-IP由于沉淀下来的是蛋白复合物，所以不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，而Pull-down可以确定目的蛋白和待检测蛋白是否发生直接相互作用，但由于其实验条件为非天然条件，可能会使实验结果出现假阳性，即因为电荷作用的影响造成的吸附，而不是生理性的相互作用。

Pull-down的应用

在体外验证两种蛋白之间是否有相互作用，主要有两个方面的应用：一是证明两种已知蛋白质之间可能存在的直接相互作用，二是用于寻找能与已知蛋白质发生相互作用的未知蛋白。也可以对Co-IP实验鉴定到蛋白相互作用关系做进一步验证。

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