用户文章Nat Comm-果蝇m6A转移酶HAKAI功能研究 | m6A专题

论文标题：Role of Hakai in m6A modification pathway in Drosophila

刊登日期：2021年4月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：11.787

研究机构：复旦大学/中科院上海植生所

技术手段：m6A测序、转录组测序

1.Hakai与其他m6A writers蛋白复合物互作且共定位

由于Hakai在哺乳动物中与其他m6A writers互作，因此作者搜索了果蝇蛋白相互作用图谱（DPiM）数据库。

Co-IP相关实验证实Hakai与Fl(2)d、Vir和Nito互作，这项研究与先前2016年Nature上研究接近（史上最详细RNA甲基化套路解读 | m6A调节果蝇性别分化和神经功能）。GFP-Hakai定位于果蝇S2细胞核，并与Mettl3、Mettl14、Fl(2)d、Nito、Flacc很好地共定位。

这些证据表明Hakai是m6A writers复合物的核心保守蛋白之一。

2.果蝇m6A修饰过程中Hakai至关重要 

Hakai在诸如卵巢、脂肪体、椎间盘等果蝇各个部位，与其他m6A writers及readers有着非常相似的表达模式。在发育过程中，它的表达在早期胚胎中高在幼虫初期下降在幼虫后期又上升。

由于纯合Hakai突变有致死作用，作者构建Hakai杂合突变果蝇。作者用LC-MS检测成虫整体m6A水平后发现，与WT对照相比，Mettl3或Mettl14突变体的mRNA的m6A整体水平下降30%，而Hakai突变体的mRNA的整体m6A水平则下降一半以上。

3.Hakai调控Sxl可变剪切及成年果蝇Phenotype 

已知果蝇Sxl可变剪切对果蝇性别Sex determination决定有着非常关键的作用。几乎所有m6A writers发生突变后，果蝇几乎都从雌性转变为雄性Sxl的可变剪切模式。

作者在Hakai突变体中检测到了与Mettl3或Mettl14突变体相似的Sxl由雌性向雄性的可变剪切模式。

接着对Fl(2)d、Vir、Nito或Flacc进行干扰后发现，不仅会导致Sxl可变剪切异常，还导致了Sxl蛋白水平大大降低。但是单独突变Mettl3、Mettl14或Ythdc1并不会影响Sxl蛋白水平。

除了Sxl可变剪切外，当m6A writers或readers发生突变时（如Mettl3、Mettl14、Ythdc1、Flacc等），会导致果蝇的翅表型发现变化继而影响其飞行。Hakai突变体产生了与Mettl3突变体相似的表型。

4.果蝇m6A修饰主要发生在5’UTR及起始密码子区域附近 

作者对WT和三种突变体（Mettl3、Mettl14、Hakai）进行m6A测序后发现，WT大部分Peak集中在3’UTR和终止密码子，而三种突变体果蝇本身总peak数发生减少且减少的主要为5’UTR的peak。而Hakai突变体与Mettl3/14突变体减少的peak特征比较相似。

接下来作者惊讶发现突变体减少的peak超过90%为5’UTR的peak。GO富集分析表明，这些减少的peak所对应的基因大多数富集在信号转导、激酶活性、转录因子活性等方面，例如神经系统发育和气管发育等。KEGG富集分析表明，大部分减少的peak所对应基因都富集在mTOR, FoxO, Wnt, Hedgehog, TGF-b, Hippo, MAPK, Notch, Toll等通路上。

5.m6A修饰不会降低果蝇mRNA水平 

转录组分析表明，突变体果蝇中分别表达了987、954和886个差异基因。这些基因用韦恩图来表示会发现几乎有大量重叠。GO富集分析表明，这些基因主要集中在免疫反应和几丁质结合上。KEGG富集分析表明，通路主要富集在碳水化合物，氨基酸和脂质代谢，这可能反映了m6A途径的间接调节作用。

转录组与m6A联合分析表明，突变体m6A peak发生减少且与差异peak相关的差异基因没有明显一样的趋势变化。进一步分析表明m6A靶基因和常规差异基因并无明显交集重叠。因此作者认为果蝇中m6A修饰介导的作用与哺乳动物中可能不同，即有效m6A修饰大量富集在5’UTR，但是不介导mRNA降解。

6.Hakai调控其他m6A writers稳定性 

Hakai是潜在的E3泛素连接酶，在Hakai不存在的情况下，作者发现在WT中Fl(2)d、Nito和Flacc是普遍共存的核蛋白。在果蝇背部对Hakai进行RNAi后不会影响Nito蛋白水平，但是会降低Fl(2)d和Flacc蛋白水平。

7.Hakai不会介导翅膀中E-钙粘蛋白水平 

Hakai与E-钙粘蛋白互作，并且在细胞培养中广泛研究了其在E-钙粘蛋白内吞和下调中的作用。使用RNAi对Hakai进行干扰后发现E-钙粘蛋白水平没有任何变化。大多数E-钙粘着蛋白在细胞膜中，而大多数Hakai在细胞核中，并且我们没有观察到这两种蛋白之间的共定位。总之，Hakai对果蝇中E-cadherin的含量并不重要，其主要功能可能发生在细胞核中。

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