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FAQ丨VITA产品在真核生物单细胞检测中的常见问题
The following article is from M20 Genomics Author 市场部
近期，我们收集了许多关于VITA产品在真核生物单细胞检测方面的实际应用问题，帮助大家更好地了解M20的产品和技术。
A:FFPE样本的制备流程为样本采集-固定-浸蜡包埋-保存。
（1）样本采集到固定的时间过长。尤其室温下放置时间过长，导致组织细胞死亡、RNA降解。手术获得组织，生理盐水冲洗以后，应立即放入福尔马林中进行固定，如果不能立刻处理，应放置冰上，不超过30分钟。
（2）福尔马林固定时间过长。固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越大，纯化难度越大。福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。因此在处理大的组织样品时，组织应当切割后再进行福尔马林固定。建议固定时间<24h，最多不超过72h。
（3）组织标本未完全脱水。石蜡包埋前的脱水步骤，将组织中的水逐步替换成醇类、二甲苯（二甲苯替代物）、石蜡。在浸蜡之前，组织标本必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。
（4）包埋石蜡的熔解温度过高。为了确保从FFPE中获取可用的核酸和蛋白，应当使用熔解温度低的石蜡，尽量避免样品降解。此外，应当避免包含添加剂如蜂蜡的石蜡，因为它们可能干扰生物分子的回收。
（5）保存时间过长。随着保存时间增加，FFPE中的RNA会进一步降解，导致可用的RNA减少。此外在一个比较不同保存温度的实验中，发现如果FFPE样品保存在4°C下RNA降解更缓慢，而不是室温或更高。
可点击《FFPE样本单细胞之旅-样本制备详解》进一步了解。
A:石蜡块和石蜡卷及切片有不同的要求：
（1）石蜡块：蜡块被包埋组织体积需要>0.5cm3。
（2）石蜡卷/切片：所用蜡块被包埋组织横截面积需>0.3 cm2 ，可切石蜡卷2-3卷，每卷厚度>50μm。蜡卷完整不破碎，放入1.5ml EP管中，常温运输。如有条件，建议备份10μm厚度切片2-3卷，进行RNA质检。某些组织类型由于同等体积下细胞数量较少，可能需要提供更多蜡卷，例如肺癌、心肌等。
A:样本包埋前染色：穿刺标本较小，往往需用伊红染色标记，否则后续包埋或切片时常常因看不清组织而影响操作，伊红染料不影响下游实验。
蜡块切片染色：样品染色应尽可能避免。某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是用于免疫组化染色的试剂。涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。
A:可以，已测试了不同组织的穿刺样本，如肝、乳腺、肾等穿刺石蜡样本。样本量需要粗针一针。临床上不同组织类型使用不同型号的穿刺针，比如18G(肝、胰腺、肺、肾)，外径1.2mm；16G（乳腺），外径1.6mm。
A:细胞核一般5-10μm，按5-10μm厚度切片，很多细胞核会被切碎，核碎片、细胞器或胞膜会存在于悬液中。虽然可以通过离心或者试剂盒去碎片的方式来去除，但碎片过多的话，细胞核数量会有比较大的损失；碎片也可能粘连在细胞核上，造成污染，影响数据分析。因此石蜡卷厚度要求50μm，至少也要达到25μm以上，石蜡卷厚度不足会为实验及分析带来风险。
A:目前已成功检测的组织类型，如心、脑、肾、肝、肺、脾、乳腺、淋巴、鼻咽喉、胸腺、前列腺、肌肉、脂肪等。
A:关注mRNA及lncRNA表达差异的单细胞分析，推荐捕获5000-10000 cells，测序量100-150G。
A:可以。
（1）VITA数据主要在cluster层面做可变剪切。
（2）从热点或者老师关注的AS和突变开始做，效率比较高，不建议做海量筛选。
（3）可先进行常规数据量（100-150G）检测，针对关注的AS、突变进行覆盖度分析，可根据具体情况进行加测。
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