M20 Seq与10x Flex石蜡包埋样本实测数据对比

FFPE样本承载大量病理信息，是公认的宝藏资源，但由于其固定步骤导致分子交联，核酸降解严重，尤其是对样本新鲜程度要求较高的单细胞转录组测序，检测难度较大。

面对沉睡的样本库，如何实现FFPE样本单细胞检测？

图片来源：视觉中国

M20 Genomics（简称M20）于2022年8月推出了基于随机引物的全样本高通量单细胞全长测序技术——M20 Seq及VITA单细胞转录组产品，通过独特的随机引物设计以及化学反应流程，可对转录本的全长进行扩增，即使在FFPE样本中也表现出了优异的检测结果。

同一时期，10x Genomics （简称10x）也推出了10x Flex技术，可对FFPE样本进行单细胞转录组测序。

一边是取得重大突破的国产技术，一边是主流国际平台，M20 Seq与10x Flex的区别有哪些？科研人员该如何根据优劣势选择更适合自己实验的平台？下面我们将从技术原理和FFPE样本实测数据对比两大方面来为大家详细阐述。

技术原理对比

01M20 Seq

M20 Seq通过对细胞进行有效固定、透化、单链DNA阻断后，使用随机引物在细胞（核）内进行原位逆转录以捕获全转录组的全长信息；并在cDNA一链末端加上捕获接头。单个细胞核中的cDNA在液滴平台或者微孔平台上完成特异性条形码标记（细胞标记），随后进行扩增和二代测序。

M20 Seq是一种适用于FFPE样本、高灵敏度、全长的单细胞转录组技术。

M20 Seq技术原理图

0210x Flex

10x Flex（原10x Fixed RNA）通过对单细胞/细胞核悬液进行固定，固定细胞内RNA的状态。然后根据人类的18000多个基因设计探针对，与每个样本的细胞内RNA进行杂交，探针上有一段barcode序列用于区分样本来源，可用于后续样本混合测序。而后通过10x Chromium X/iX进行单细胞捕获，接着进行文库构建和数据分析。

10x Flex技术原理图

10x Flex的探针杂交技术与M20 Seq的随机引物原理有很大差异，那双方在样本类型、物种覆盖范围、实验周期、生信等方面的优劣势如何呢？

表1.双方技术原理差异
从以上的对比中，我们不难看出，M20 Seq在物种类型上覆盖更广，可分析的RNA类型也更多。
除了基础要求和性能外，如何选择一款更优质的单细胞检测平台，还要看其在实测样本中的数据表现。我们委托某第三方专业机构将保存两年的前列腺癌石蜡包埋组织，同时使用M20 Seq与10x Flex技术进行单细胞检测，一起来看数据表现如何：

同一样本实测数据对比

01基础数据

在相同数据量情况下进行分析比较（表2），10x Flex饱和度为92.79%，基因中位值为1243，总基因数为15558；M20 Seq饱和度为57.45%，基因中位值为1002，总基因数为31141。将M20 Seq文库加测后，当基因中位数达到1287时，M20所使用的测序饱和度仅为65.5%。

表2.基础数据

从基因饱和度曲线来看，10x Flex饱和度已经到平台期，但M20 Seq仍有较大增长空间。（图1）

图1.饱和度曲线对比图

以下所有数据分析均基于双方相同数据量的情况进行。

02基因检测总数

M20 Seq检出的基因总数为31141，10x Flex检出的基因总数为15558（二者统计均不包括线粒体和核糖体的基因及少于三个细胞内表达的基因）。

两个平台overlapped基因数为14357，M20 Seq的特有基因检测数为16784，比10x Flex的特有基因检测数1201多出15583个。

图2. 检测基因总数对比

03全长覆盖分析

M20 Seq基于随机引物对RNA全长进行无偏捕获，但由于FFPE是降解样本，3'端降解，因此5'的覆盖度略高于3'。10x Flex则在3'端的捕获有明显下降趋势。

图3.5'-3'覆盖度对比

对于单细胞核水平上的RNA覆盖率，M20 Seq的覆盖率远高于10x Flex。

图4.单细胞核RNA覆盖对比图

横坐标为外显子及内含子序列的覆盖度，纵坐标为细胞数量

对于单基因水平上的RNA覆盖，对前列腺癌AR以及相关同源重组修复（HRR）基因进行分析，M20 Seq的序列分布在外显子区和内含子区，10x Flex获取的序列仅限于探针靶区（< 100 bp）。图5.单基因RNA覆盖对比图

04

基于mRNA聚类注释分析

仅使用mRNA，取前3000个高变异基因进行降维聚类分析，基于singleR自动注释。M20 Seq比10x Flex多检出一个细胞亚群（图6），两者在细胞注释方面基本一致（图7）。图6.仅基于mRNA进行降维聚类
图7.SingleR注释

05

非编码RNA分析

（1）占比分析

M20 Seq除了常规的mRNA分析外，可以同时分析非编码RNA。以lncRNA为例，该样本在M20 Seq检测数据中，每个细胞lncRNA占比在6%-30%，而10x Flex没有覆盖lncRNA。

图8. lncRNA占比分析对比

（2）聚类注释分析

取前3000个高变异基因（利用mRNA以及lncRNA共同注释）进行降维聚类，M20 Seq获得22个亚群，比仅使用mRNA聚类多了4个亚群，比10x Flex多了5个亚群。SingleR注释后比10x Flex增加了中性粒细胞群、平滑肌细胞群（图6、7、9）。这证明增加lncRNA可提升细胞聚类注释效果，有可能发现新的细胞亚群。

图9. M20 Seq基于mRNA以及非编码RNA进行降维聚类、SingleR注释  

（3） lncRNA降维分析

利用前3000 lncRNA单独进行降维分析，也可以看到细胞亚群间的区分，说明通过M20 Seq方法，很有可能在单细胞中寻找出具有重要意义的lncRNA。

图10. M20基于lncRNA降维分析

06

Maker genes表达情况

M20 Seq检测结果发现了与10x Flex不同的Marker genes，有可能为研究人员带来新的研究思路。

图11. Marker genes气泡图对比  

综上，M20 Seq在基因检测总数、RNA捕获类型、新细胞类型挖掘等方面有独特优势。未来，M20的产品和技术势必将在FFPE单细胞核转录组领域开拓更多研究可能，全面助力单细胞测序领域迈向临床应用时代。



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