高分SCI无人区来了！FFPE单细胞技术解锁临床回顾性研究新选题 | 单细胞专题
The following article is from M20 Genomics Author 学术部
为提升临床诊疗水平，进行前瞻性研究、回顾性研究、多组学联合分析是绕不开的话题。M20 Seq作为国产自研的单细胞创新技术，突破性地实现了FFPE样本的高通量单细胞检测，在多个样本上展现出了优异性能。近期，M20 Seq技术方法学文章发表在Nature Communications上，成为了全球首篇FFPE样本高通量单细胞的SCI。
M20 Seq的问世如同一把打开沉睡样本库的钥匙，让FFPE样本的高通量单细胞临床研究成为触手可及的现实。未来，临床医生们是否可以通过这个国产新技术产出源源不断的高分SCI呢？本期我们先来谈谈临床医生们最关心的FFPE应用场景——回顾性研究。
回顾性研究
由于疾病是一个动态的过程，除了横断面研究外，几乎所有的研究都涉及疾病自然发展、治疗或其他暴露因素发生前后的临床样本，时间跨度较长。同时，为了保证实验的一致性，实验中涉及的生物样本取材条件要尽可能保证一致。并且，临床研究有很多难以控制的外来因素，比如研究对象的同质性和依从性。研究者不能完全支配病人的行为，只能对病人提出一些要求，以避免干扰试验的行为或“失访”事件的发生。
而回顾性研究是利用临床工作中现有的临床资料进行回顾性总结、分析的一种研究方法。具有占用人力资源较少，不需要太多的经费，不干扰正常的临床工作，不存在伦理问题，研究周期短的优点。不同于只有一小部分病例才有足够进行研究的新鲜样本，可长期保存的FFPE样本拥有丰富的患者临床数据关联。回顾性研究可以根据课题设计，直接从样本库中选择合适的FFPE样本进行研究。
FFPE样本的回顾性研究案例
01分型诊断
利用FFPE样本进行回顾性研究可用于区分疾病亚型，辅助诊断，从而制定更适合的治疗方案。
在一项题为“RNA-seq from archival FFPE breast cancer samples: molecular pathway fidelity and novel discovery”的研究中，作者对58个在室温下保存了2-23年的乳腺癌FFPE样本进行了单基因、基因集和转录网络的调控分析[1]。研究发现，靶向基因集可以有效地区分ER+和ER-乳腺癌。同时，调控分析发现，转录因子KDM4B与ER+分型相关，在一个独立的ER+病例队列中，KDM4B调控活性和基因表达具有预后意义。这一研究结果概述了一个可用于FFPE样本RNA-seq的通用方式，可用于区分缓和性和危及生命的疾病，为利用FFPE组织解决乳腺癌领域的关键问题奠定了基础。
文章深度扩展建议在这一研究中加入单细胞测序分析，可进一步分析单个细胞的状态，推进治疗耐药性的分子机制等方面的研究。
02评估预后
FFPE样本因其可长期保存，并可与如病理诊断、预后情况等丰富的临床数据相关，通过其进行的回顾性研究可用于评估患者预后，辅助医生制定更有效的治疗方案。
2023年6月发表的一项回顾性研究收集了68名子宫透明细胞癌患者的临床数据及FFPE样本，分析了这些患者的临床特征、治疗方法和结果[2]。研究发现当此类子宫癌患者具有免疫反应相关基因高表达的转录组特征时，可显示出非常好的总体预后，提示具有这一特殊特征的患者可能是免疫治疗的候选者。
一项题为“Gene expression analysis in formalin fixed paraffin embedded melanomas is associated with density of corresponding immune cells in those tissues”的研究提到，黑色素瘤的免疫细胞浸润具有重要的预后价值，通过对FFPE黑色素瘤样本的基因表达分析可以量化其中多种免疫细胞亚型的数量和功能，从而作为评估患者预后的重要参考[3]。
在另一项回顾性分析报道中，研究者收集了一批乳腺癌脑转移患者的FFPE样本，及对应的临床信息、病理特征、转移情况和患者总生存期等，评估了其原发/转移病灶中的生物标志物（ER、PR、HER2）和Ki-67指数表达水平的差异，并分析了这些差异与乳腺癌患者生存率的相关性[4]。研究结果提示了原发病灶和脑转移病灶之间ER、PR和HER2表达水平的差异以及Ki-67指数的变化可能预测患者的生存时间，并为乳腺癌个体化治疗策略的探索提示了重要方向。
文章深度扩展建议FFPE样本的单细胞检测可以直观、准确地得到样本中免疫细胞亚群的组成与功能相关的信息，从而排除混池分析带来的均一化、背景噪音的干扰，并得到更精准的患者预后参考。
如果能在癌症转移复发研究中，加上对原发病灶和转移病灶的FFPE样本单细胞测序分析，或比较复发前后FFPE样本的细胞类型、基因表达情况，可以更清晰地判断肿瘤细胞转移相关的细胞亚群，深入挖掘癌症复发机制，更准确地预测患者预后，并指导个体化治疗。
03预测治疗效果
通过FFPE样本进行的回顾性研究还常用于分析疾病治疗的临床效果，探索治疗机制，并对患者的耐药性做出预测。
一项2023年4月发表的研究对103例食管鳞状细胞癌患者的FFPE组织进行了转录组分析，并寻找可能预测新辅助免疫疗法耐药性的候选生物标志物，评估免疫疗法抗性的推测机制[5]。研究确定了一个独特的食管鳞状细胞癌亚型，具有PLEK2和IFI6高表达的特征，这一类患者不能从新辅助免疫治疗中获益，并呈现出较差的生存率。
文章深度扩展建议
在这一基础上，单细胞测序分析可进一步探索对治疗有反应的细胞亚群，分析其中的分子机制，并可能拓展疾病治疗的新思路。
以上分享的文献案例中，研究者都应用了大量的FFPE样本来进行回顾性研究。然而大部分案例中都只进行了混池转录组测序、有限的靶向基因表达检测、免疫组化分析，对FFPE样本中所包含的分子信息分析程度较浅，整体样本研究深度不够。如果能在这些传统分析的基础上进一步深入挖掘，加入高通量单细胞测序，并结合多组学技术，可全面提升文章深度，冲刺高分SCI。
目前，M20 Seq已全面商业化，能够支持临床医生们开展大量回顾性研究。如有感兴趣的同仁，可以联系M20 Genomics的官方授权服务商联川生物进行合作。相信第一个探索FFPE样本高通量单细胞SCI无人区的人就是你。
参考文献
1. Pennock, N. D., Jindal, S., Horton, W., et, al. (2019). RNA-seq from archival FFPE breast cancer samples: molecular pathway fidelity and novel discovery. BMC medical genomics, 12(1), 195.
2. Nigon, E., Lefeuvre-Plesse, C., Martinez, A., et, al. (2023). Clinical, pathological, and comprehensive molecular analysis of the uterine clear cell carcinoma: a retrospective national study from TMRG and GINECO network. Journal of translational medicine, 21(1), 408.
3. Kwak, M., Erdag, G., and Slingluff, C. L., Jr (2020). Gene expression analysis in formalin fixed paraffin embedded melanomas is associated with density of corresponding immune cells in those tissues. Scientific reports, 10(1), 18336.
4. Jiaxin, C., Jinmei, Z., Huiqiang, Z., et, al. (2022). Conversion of ER, PR, HER2 and Ki-67 and Prognosis in breast cancer metastases to the brain. Frontiers in neurology, 13, 1002173.
5. Liu, J., Chen, H., Qiao, G., et, al. (2023). PLEK2 and IFI6, representing mesenchymal and immune-suppressive microenvironment, predicts resistance to neoadjuvant immunotherapy in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer immunology, immunotherapy, 72(4): 881–893.
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