单细胞多组学专题：Cell揭示人心脏发育的空间基因表达模式及细胞图谱
期刊名称：Cell
发表时间：2019
所用组学：空间转录组（ST RNA seq）、单细胞转录组测序（Sc RNA seq）和原位测序（ISS）
人类心脏形态形成的过程研究尚不深入。随着单细胞和空间转录组测序的发展为研究不同发育时期的人心脏样本的细胞基因表达模式带来了新的机遇。在本文中，作者揭示了胚胎心脏在三个发育阶段的细胞类型的全面转录景观，并将细胞类型特异性的基因表达映射到特定的解剖区域。
空间转录组学鉴定了在每个发育阶段对应于不同解剖区域的独特基因谱。通过单细胞转录组测序鉴定的人类胚胎心脏细胞类型证实并丰富了胚胎心脏基因表达的空间注释。然后使用原位测序来完善这些结果，并为三个发育阶段创建空间亚细胞图。
最后，作者还生成了一个公开的人类心脏发育的网络资源，以促进未来对人类心脏的研究。
➢空间转录组测序：沿着背腹轴分别从4.5-5、6.5和9周胎龄（PCW）心脏组织中收集了4、9和6个组织切片；
➢单细胞转录组测序：6.5-7周胎龄（PCW）心脏组织
➢ISS实验：4.5-5、6.5和9周胎龄（PCW）心脏组织
1、人心脏发育过程中的空间基因表达特征
首先，通过免疫组化（IHC）对4.5-5、6.5和9 PCW采集的人胚胎心脏样本的组织切片进行染色，获得了人心脏发育的时空概况（图2A-2C）。这表明，左右心室以及左右心房（TNNT2）的自由壁和间隔在所有时间点都是由紧凑的小梁心室心肌组成。
此外，平滑肌肌动蛋白（ACTA2）染色显示，4.5-5 PCW的心脏主动脉和肺动脉开始形成，6.5和9 PCW的心脏已经进一步发育。DAPI染色显示三个时间点均有心外膜边界包裹心脏。
然而，在6.5和9 PCW期，冠状动脉（ACTA2）的心房和心室（AV）心外膜间质形成仅在AV沟的上端可见。最后，在大动脉进入纵隔的心包腔末端，可以观察到大量的肺静脉纵隔组织（ACTA2），仅在6.5和9 PCW心脏可见。
综上所述，ICH揭示了人类心脏发育过程中蛋白质的时空表达模式。
图1：三个心脏发育阶段的空间基因表达特征
Tips：上图可通过联川星云绘制
作者采用空间转录组（ST）来探索人类心脏发育过程中的全局时空基因表达动态。通过计算样本之间的基因表达相关性，结果表明在所有发育阶段的整体基因表达模式都非常相似。降维和聚类分析的结果表明一共鉴定到10个时空保守的Cluster（图2D-E）。主要的心肌细胞区域（Cluster 0、1、2、3和4）存在于所有发育阶段，且与肌肉收缩和发育相关，且相应的Cluster中的Spots数量会随着年龄增长而增加，这反映了心脏的生长过程。
图1：三个心脏发育阶段的空间基因表达特征
Tips：上图可通过联川星云绘制
进一步的，作者对解剖区域之间的差异基因表达分析及对每个Cluster中上调基因进行富集分析（图2H）。Cluster 1、2和3为三个小梁状细胞群，主要是在传导和氧化代谢中富集。Cluster 2中MB和NPPA呈现差异表达模式，而这与增强的氧气运输和内分泌活性有关（图2H）。上述结果表明，不同的小梁心肌细胞簇可能对应于小梁的不同组成部分。
OFT、AV、纵隔间质以及心外膜（Cluster 5、6、7和9）表现出较为相似的GO特征；它们与细胞外基质、不同程度的脉管系统和动脉形态发生相关。此外，Cluster 5、6和7还与心脏瓣膜和隔膜发育相关。在6.5和9 PCW的样本中，对Cluster 5（OFT）中含有与成纤维细胞相关的细胞外基质基因（如ELN、SPARC和OGN）的表达以及平滑肌相关基因（例如ACTA2和MYH11）的表达（图2H）。而在4.5-5 PCW组织的AV间质的远端部分，这些基因表达并不是很高。上述结果表明，OFT从AV间质中生长出来，但其肌肉化和较大血管的形成开始于远端的心脏神经嵴细胞。
在研究的时间范围内（4.5-9 PCW），空间基因表达在胚胎发育早期建立并在整个发育过程中维持，心脏内区域之间的基因表达差异比不同发育时间节点之间的差异更明显。
图1：三个心脏发育阶段的空间基因表达特征
Tips：上图可通过联川星云绘制
2、6.5-7 PCW人胚胎心脏单细胞基因表达模式
进一步，作者使用scRNA-seq分析了6.5-7 PCW组织样本的基因表达异质性。IHC染色表明中间发育阶段可以表现出其他两个发育阶段中识别的解剖特征。该组织被分成两个区域不同的部分：一个包含OFT、房室结构、和大部分心房，另一个包含心室。这有利于细胞的分离，同时还保留了关于所研究的细胞是否来自心脏的上部或下部的信息。
作者首先对比了两个样本（6.5-7 PCW组织样本）的scRNA-seq和ST基因表达的相似性。两者之间的相关性很强（图3A），这也证明了两者做生物学重复是很合理的。在ST样本中唯一检测到的大多数基因是Y连锁基因（例如TTTY14、TTTY15和ZFY），这是由于不同性别导致的结果。在scRNA-seq样本中，XIST基因的过表达进一步证实了这一点。此外，当检测仅在scRNA-seq样本中发现的基因时，观察到与免疫反应（FCGR2B和IL6）以及细胞增殖和凋亡（IL1B）相关的基因，这表明在单细胞文库制备之前的解离步骤中这些过程被激活。
聚类分析的结果表明一共鉴定出15个Clusters（图3B），根据标记基因可鉴定出已知的心肌细胞类型，从心肌细胞和成纤维细胞到平滑肌细胞和内皮细胞。此外，作者还检测到三种心肌细胞、心脏神经嵴细胞、雪旺祖细胞、心外膜细胞、EPDCs、两种内皮细胞和四种成纤维样细胞。这些Cluster仅在心脏上部检测到（图3C），表明心脏上部细胞多样性丰富，其中包括OFT、心房的主要部分、AV心外膜下间质、瓣膜器和带有肺静脉的纵隔组织。
图2：6.5-7 PCW的人胚胎心脏的单细胞图谱
Tips：上图可通过联川星云绘制
3、一个发育中的心脏细胞基因表达图谱
为了阐明人类胚胎心脏中存在的不同细胞类型的空间分布及其空间分布的异质性，通过将原位测序（ISS）应用于ST分析的3种心脏组织来研究亚细胞空间分辨率，从而实现了在单细胞分辨率下对基因进行空间表达分析。作者采用前面两个匹配的6.5-7 PCW样本的ST和scRNA-seq分析的信息，设计了一个panel。该panel包含由ST识别的关键空间标记基因，scRNA-seq簇（免疫细胞除外）的标记基因以及对心脏发育重要的基因，最终得到了含有69个基因的panel。通过对该panel进行聚类分析，结果表明该panel能将大多数细胞匹配到原始细胞簇中。其中Cluster 13不含特定的标记基因。通过进行ISS实验，结果表明不同发育阶段的高度相关性。该实验结果也在单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）实验中得到了验证（图4）。
此外，作者通过采用ISS和pci-Seq的方法，利用在6.5-7 PCW人类胚胎心脏中scRNA-seq鉴定的细胞类型，构建了全面空间细胞图谱（图5）。除了空间位置之外，细胞映射算法还利用scRNA-seq数据将读取分配给单个细胞（图5A，C和E）。
该空间图谱包括20920个单细胞，且这些单细胞被成功地分配到由scRNA-seq定义的细胞类型中（图5B和D）。空间细胞映射证实了ST预测的簇的空间分布，也解决了由彼此临近的不同细胞类型形成的更精细的结构。
图5：人类在中期发育中心脏的细胞图谱
4、基于空间分析的细胞类型相似性解析
ISS分析显示，在6.5-7 PCW心脏中，空间基因表达模式与ST和scRNA-seq结果一致（图6A-B）。根据ISS的结果，通过将scRNA-seq结果与相应的空间标记基因进行比较，作者深入的对scRNA-seq簇进行了深入的探讨。在Cluster 14中确定了两种细胞亚群：表达ISL1和STMN2的心脏神经嵴细胞和表达ALDH1A1的雪旺祖细胞（图6A）。两种细胞类型均存在于纵隔间质和OFT中，并且在AV心外膜下间质中也检测到雪旺祖细胞。通过分析三个发育阶段OFT内这些基因的ISS模式，作者发现心脏神经嵴细胞仅在早期出现，而雪旺祖细胞仅在晚期出现（图6C和D）。此外，在任何发育阶段，房室心外膜下间充质中均未发现心脏神经嵴细胞，但在晚期阶段，雪旺祖细胞在该区域普遍存在（图6E和F）。
图6：心脏三个发育阶段的靶向空间基因表达模式分析
Tips：上图可通过联川星云绘制
此外，作者还探究了心外膜细胞（Cluster 9）和epdcs（Cluster 3）之间的差异。心外膜细胞的标记基因为ITLN1，在心脏周围的心外膜层中发现。标记基因TBX18在两种细胞中均有表达，而TCF21更多地定位于EPDCs所在的心外膜下（图6B）。图6E和图6F的显示了三个发育阶段的AV心外膜下间质的心外膜细胞（ITLN1、TBX18）和EPDCs（房室心外膜下TBX18）间充质内的定位。在4.5-5PCW的心脏中，心外膜几乎不覆盖心脏的心包表面，仅可检测到发育心外膜的痕迹。在后续的两个发育阶段，EPDC形成并填充了AV心外膜下间质。
图6：心脏三个发育阶段的靶向空间基因表达模式分析
作者进一步解析了由EPDCs（Cluster 3）和成纤维细胞样细胞（Cluster 2、4、5和8）组成的scRNA-seq簇（图3B）。结果表明，这些细胞群具有独特的空间位置和功能特性。EPDCs主要存在于AV心外膜下间质（图6G），主要参与器官和肌肉发育。在成纤维样细胞中，与Cluster 2相关的细胞主要位于OFT的底部和瓣膜内，而Cluster 5主要位于OFT内，参与其形态形成过程。
此外，Cluster 5还存在AV心外膜下间质中，揭示其参与冠状动脉形成。Cluster 4和8具有相似的空间分布状态。不同的是，Cluster 4在心外膜中更明显，参与结缔组织发育和血管生成，而Cluster 8更多的定位于OFT，与动脉和主动脉形态发生和内皮细胞增殖的调节更相关。
图6：心脏三个发育阶段的靶向空间基因表达模式分析
重要的是，作者还检测到了三种类型的心肌细胞（图3B），它们在所有三个被研究的发育阶段都被检测到。其中两种细胞表达了心房和心室心肌细胞的标记基因，并与其空间定位一致。此外，作者还鉴定到了一个新的Cluster ，该Cluster表达MYOZ2和FABP3，即定位于心房，有同时定位于心室。
最后，作者对两种内皮细胞类型（Cluster 0和10）进行深入分析。结果表明，Cluster 0（毛细血管内皮）主要定位于小梁心肌，此处的血液主要通过较小的血管（主要是毛细血管）提供。相反，Cluster 10（内皮/周细胞/外膜）主要定位于致密的心肌中，冠状动脉向心脏提供富氧的血液。以上这些结果均表明空间基因表达在区分相似细胞类型的定位和功能的关键作用。
图6：心脏三个发育阶段的靶向空间基因表达模式分析
此外，作者提供了一个公开的网络资源，以直观地探索调节人类心脏发育的空间基因表达模式。
（https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-dev
elopment/）
该数据库包含用于分析ST和scRNA-seq数据的浏览器、ISS信息的图谱以及6.5 PCW胚胎心脏的3D图谱。构建3D模型的9个ST组织切片可以查询全局和单个空间基因表达模式，以研究心脏器官发生的一般和详细动态（图7A）。此外，从ISS数据获得的空间单元图与3D模型对齐，以提供单元分辨率（图7B）。
图7：三维基因表达图谱
➢全面解析了人心脏发育过程中的空间基因表达模式
➢绘制了人类胚胎心脏的细胞类型和空间分布特征
➢深入探讨了不同细胞类型在心脏发育中的作用机制
➢建立了一个关于人类胚胎心脏的公开获得的网络资源。
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杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近百篇，影响因子平均15+。
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