单细胞研究揭示心力衰竭相关细胞类型，心脏FFPE样本单细胞研究如何遍地开花？"|单细胞专题

心力衰竭（简称HF）是各种心脏疾病的严重表现或终末阶段，被称为心血管疾病最后的战场。一篇名为《Integrative Analysis of Bulk and Single-Cell RNA Sequencing Data Reveals Cell Types Involved in Heart Failure》的文献，通过单细胞测序技术对HF的发病机制进行了研究。

在研究中，作者对公开的转录组数据集进行分析，包括正常（NF），扩张型心肌病（DCM）和缺血性心肌病（ICM）心脏组织，发现了HF中明显改变的潜在基因——内皮细胞（EC）和心脏纤维化的特异性生物标志物，并对与炎症相关的细胞粘附分子（CAM）、细胞外基质（ECM）基因和免疫应答的差异进行验证。

人左心室细胞类型的鉴定和表征

作者收集了早期研究的两个左心室scRNA-seq 数据集。通过t-SNE分析，细胞分别聚集成18个簇（图1A）。使用scHCL方法，成功地注释了心脏的11种细胞类型（图1A）。标记基因在各细胞类型中特异性表达（图1B）。

图1.两个人左心室中细胞类型的分类和分子表

细胞类型标记基因在心力衰竭中显著改变
作者分析了先前研究中NF、DCM 和ICM 样本的基因表达谱（bulk RNA-seq）。主成分分析（PCA）和差异表达分析显示，三组样本表现出显著不同的表达模式（图2A，B）。通过细胞类型标记基因的基因集富集分析（GSEA）发现，成纤维细胞和内皮细胞（EC）的标记基因在DCM和ICM中显著上调，表明两类细胞的功能障碍可能与DCM和ICM有关。此外，树突状细胞，M1 / 2巨噬细胞，中性粒细胞和平滑肌细胞的标记基因特异性地富集在ICM上调基因中。这些结果表明，DCM和ICM在心力衰竭发病机制上具有相似性和特异性。
图2.扩张型心肌病（DCM）和缺血性心肌病（ICM）中的差异表达基因
心力衰竭内皮细胞和成纤维细胞的关键调节因子

由于内皮细胞和成纤维细胞响应HF而被激活，作者收集了NF，DCM和ICM左心室1082个内皮细胞的scRNA-seq数据。在HF内皮细胞中发现24个EC标记基因上调（图3B）。代谢富集分析确定CAM是参与HF发病机制的关键调节因子，包括CD74，HLA-B，HLA-E，HLA-DRB1，HLA-DQA1，HES1和CLDN5。

转化生长因子β1（TGFβ1）是成纤维细胞活化的主要因子，在心脏纤维化中起重要作用。29个成纤维细胞标记基因在TGFβ1处理的HF组织和成纤维细胞中也上调（图4B）。LTBP2、LTBP1、COL3A1、MFAP4、COL12A1、COL1A1、COL1A2、MMP2、TIMP2和PCOLCE2主要参与细胞外基质（ECM）组织和胶原蛋白的生物发生/形成/降解。结果表明，炎症相关的CAM和ECM蛋白分别由内皮细胞和成纤维细胞特异性分泌，并可能在心力衰竭期间诱发心脏炎症和纤维化。

图3.参与HF的内皮细胞（EC）相关关键调节因子的表达模式（A）HF的EC中特异性上调的基因，通过基因集富集分析（GSEA）鉴定

图4.参与HF的成纤维细胞相关关键调节因子的表达模式

趋化因子信号激活与ICM中更高的炎症有关

ICM比DCM具有更特异性的免疫细胞类型。中性粒细胞和巨噬细胞在ICM中的活性高于DCM和NF。与DCM和NF相比，ICM中性粒细胞和巨噬细胞自分泌配体CCL3和CCL4以及受体CCR5在ICM中特异性上调（图5D）；其相互作用诱导趋化因子信号激活可能是ICM免疫反应与较高的炎症的原因（图5C）。

图5.免疫细胞标记基因在ICM中的特异性表达模式

在独立数据集中验证炎症相关 CAM、ECM 基因和免疫反应
作者使用其他已发布数据集进行验证。炎症相关的CAMs如HLA-E、HLA-DQA1、HLA-DRB1和CD74以及所有ECM基因在HF混池测序结果中均上调(GSE121893，图6A)。在独立的scRNA-seq数据集中，HF成纤维细胞中的ECM基因也上调(图6B)。此外，与NF和DCM相比，在验证数据集中也观察到ICM中自分泌配体受体对CCL3/CCL4-CCR5的上调(图6C, D)。同样，CCL3和CCL4在ICM巨噬细胞中的表达高于DCM和NF(图6E)。

这些结果进一步表明，内皮细胞和成纤维细胞特异性分泌的炎症相关CAMs和ECM蛋白，以及中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子信号激活可能诱导心力衰竭时心脏炎症和纤维化。

图6.验证细胞粘附分子 （CAM）、细胞外基质 （ECM） 基因和免疫反应
综上，内皮细胞和成纤维细胞可以响应HF而被激活。DCM和ICM在HF的发病机制上具有共性和特异性。ICM中较高的炎症可能与自分泌CCL3/CCL4-CCR5相互作用诱导的趋化因子信号激活有关，ICM中性粒细胞和巨噬细胞的活性高于DCM。这些发现确定了以前被低估的ICM和DCM之间细胞及转录组异质性的特征。


在我国，35岁以上的心衰患病率大于1.5%，全国心衰人群超千万。作为一种慢性进行性疾病，其发病率、死亡率高。近年来，越来越多的科研人员通过单细胞测序技术研究心衰的发病机制，期待帮助临床医生在心血管疾病最后的战场抢救更多病人。
许多心脏病理样本都以FFPE样本形式保存，这类样本由于RNA降解严重，此前无法通过传统单细胞技术进行研究。2022年，M20 Seq及VITA系列产品推出后，通过随机引物原理实现了FFPE样本的检测。
截至目前为止，我们的产品已经检验了多个FFPE样本，均展示出了良好性能。表1中的FFPE样本实际检测细胞数均较多，且基因检出率较高。
表1.FFPE样本基本信息

今天我们一起来看看VITA产品在3例人心脏FFPF样本中的实测结果：

01 基础数据

利用M20 Genomics平台完成细胞核原位逆转录，在VITACruiser仪器上完成细胞捕获及标记，基于Illunima Novaseq6000平台进行二代测序。3例人类心脏样本平均测得130G数据，有效细胞数分别为8071、8252、10217个（表2，图2-4），检测基因总数分别为42891、41532、43813，基因中位值分别为898、1071、1046，UMI中位值分别为1404、1698.5、1601，测序饱和度则分别为40.5%、64.4%、32.2%。从结果来看，基因检出率较高。

表2.人心脏FFPE样本基本信息

02 有效指标

M20全长转录组一大优势就是能够对RNA进行全长无偏倚捕获，下图为5'-3'基因覆盖情况，可知三个样本测序数据均全长覆盖，且覆盖度均一，无明显偏好。

图1.基因覆盖图

有效细胞数的确认在单细胞分析当中至关重要。M20 Seq根据有效液滴指标筛选合适细胞数，左图为Barcode对应UMI数；右图为Barcode对应基因数，具体见下：
图2.人心脏FFPE样本1有效指标图
图3.人心脏FFPE样本2有效指标图

图4.人心脏FFPE样本3有效指标图

03 lncRNA分析

长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明，lncRNA在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，是目前的研究热点之一。

基于独特的随机引物捕获原理以及相应的特殊生物化学反应流程，VITA平台可以对样本细胞中的lncRNA信息进行进一步的分析。

图5-7从左至右分别展示了3个样本的基因数、基因UMI、线粒体基因百分比、lncRNA UMI、lncRNA数。由图可知，3个样本基因中位值分别为898、1071、1046，其中lncRNA占比分别为12.5%、13.9%、15.2%，lncRNA基因中位值分别为112、149、159。

图5.人心脏FFPE样本1小提琴图
图6.人心脏FFPE样本2小提琴图
图7.人心脏FFPE样本3小提琴图

04 单个样本降维与聚类分析结果

选择前3000个高变异基因进行leiden算法聚类和UMAP算法降维分析，结果显示3例样本分别可分为16、16、20个细胞亚群（图8-10A）。同时，使用UMAP算法对前3000个高变异lncRNA进行降维，分析结果显示通过lncRNA也可以非常好地进行细胞的区分（图8-10B）。以上结果表明通过VITA平台，很有可能在单细胞中寻找到具有重要生物学意义的lncRNA。

图8.人心脏FFPE样本1UMAP聚类图
图9.人心脏FFPE样本2UMAP聚类图

图10.人心脏FFPE样本3UMAP聚类图

05 样本合并降维与聚类分析结果

对3个样本进行合并去批次分析，之后采用UMAP进行可视化展示，分析结果显示，M20 Seq可以得到清晰的样本分群结果，且3个样本之间既有共通的细胞群，也有样本特异细胞群。

图11.3例人心脏FFPE样本聚类结果以上结果展示了VITA系列产品在实测数据中的优异表现，充分说明了M20 Seq的可靠性，为科研人员研究心脏FFPE样本提供了更多的单细胞技术选择。随着我们对心脏的了解越来越深，相信未来心脏疾病的治疗方式会越来越好。有感兴趣的科研人员可以通过M20官方授权的服务商联川生物进行科研合作。

关于联川

ABOUT LIANCHUAN

杭州联川生物致力于为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。

单细胞和空间转录组测序作为联川重点科研服务产品，目前已经搭建完成包括10x单细胞测序（ScRNA-seq、ScRNA-seq＆VDJ及ScATAC seq），10x空间转录组测序（Visium 、CytAssist），10x Xenium及华大时空组学（stomics）测序平台。联川生物实现从nm到um，从单细胞到亚细胞的全生态单细胞空间原位检测的布局。在样本制备和生物信息学分析，以及云分析平台方面充分发挥自身优势，联川生物致力于为客户提供优质的服务。

目前已经与多个国家及地区的100多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞和空间转录组测序相关的SCI高质量论文已超过130篇，影响因子平均15+，其中空间转录组相关文章10余篇（包含单细胞&空间转录组联合分析文章）。联川在单细胞&空间组学整合分析具备成熟的流程和云分析工具，对于数据挖掘和生物学故事具备深度的理解力，是值得信赖的多组学整合专家！