⑩miRNA作为宫颈癌分子标记物的筛选和鉴定 | 科研故事
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李阳 浙江大学
背景介绍
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。高危型HPV（人乳头状瘤病毒）持续感染是宫颈癌的主要危险因素。90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。早期发现和治疗宫颈癌和癌前病变，将会显著降低宫颈癌的发病率和死亡率。miRNA调控基因表达以及可作为多种疾病标志物的作用已引起研究者的高度关注。
我们课题组长期专注于妇科肿瘤，特别是宫颈癌的治疗，希望全面系统地在宫颈癌组织中筛选和鉴定出miRNA分子标记物，为将来指导临床打下基础。我们组前后历时5年做了以下一些工作。
研究内容
1. 宫颈病变组织miRNA表达谱的建立及miRNA-HPV相关靶基因网络预测图
我们成功完成宫颈正常组织、HPV16亚临床感染宫颈正常组织、HPV16阳性CIN2-3宫颈组织、HPV16阳性宫颈癌miRNA芯片检测，获得不同HPV16感染状态下宫颈组织miRNA芯片表达谱，并且通过进一步扩大样本验证了miRNA表达的差异（图1）。
发现不同病变组别间差异表达miRNA 31个，其中在宫颈癌中12个上调，13个下调，同时发现HPV16阳性和阴性的正常宫颈组织间差异表达miRNA 16个，HPV16阳性组织中8个上调，8个下调。利用NCBI数据库搜索得到和HPV感染有关的基因列表；通过MiRDB、TargetScan、SangerMicroRNA数据库，筛选得到差异表达的miRNA调控的靶基因，根据miRNA和靶基因的属性关系，构建miRNA-HPV相关基因作用网络。而后，根据网络中miRNA的位置函数计算出miRNA在网络中的关系强度，即miRNA的网络特征值，特征值最高microRNA处于网络的枢纽性地位，即miR-29。在功能验证的基础上，进一步研究miR-29在宫颈癌发生发展过程中的重要作用。
基于上述miRNA芯片表达谱筛查结果，我们又接着从四个角度对miRNA在宫颈癌发生发展中的调控机制进行了探讨。
2. miRNA在宫颈癌发生发展中的作用及机制研究
进一步的研究取得了一系列有价值的研究成果，并发表了四篇论文：a）miR-424通过靶向调控Chk1的表达，抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭（图2）；b）miR-375通过作用于Sp1参与宫颈癌迁移、转移等与宫颈癌进展有关的生物学行为（图3）；c）miR-100在宫颈癌下调是宫颈癌发生的晚期事件（图4）；d）miR-375参与宫颈癌泰素敏感性调节的机制研究（图5）。
图3 miR-375或SP1调控宫颈癌SiHa和CaSki细胞的增殖和细胞周期
图4 宫颈癌组织中PLK1蛋白表达与miR-100表达负相关
有了上述研究基础，我们的信心更足了，决定扩大考察范围，在上千例HPV阳性病例中进一步评估miRNA作为宫颈癌筛查标记物的价值。
3. 宫颈脱落细胞中miRNA检测在HPV阳性女性中的分流筛查价值
我们选择了6个候选位点（miR-218、miR-375、miR-424、miR-34a、miR-92a、miR-93），在符合入组条件的1021例HPV阳性有效病例的宫颈脱落细胞中用stem-loop RT-qPCR方法检测这些候选miRNA位点的表达水平（图6），进一步通过ROC曲线分析评估了miR-218、375、424、34a在HPV阳性妇女中的分流筛查价值（图7），并与TCT检查相比较，通过Pearson相关性分析、Logistic回归分析等发现基于miR-218、424、375的多位点联合检测能进一步提高其筛查效能。
证实了部分miRNA位点在不同宫颈病变的宫颈脱落细胞中的表达存在显著差异。初步探索并揭示了miR-424和miR375等miRNA位点作为宫颈癌筛查的新的分子标记物在HPV阳性妇女中的分流筛查价值，为宫颈癌筛查提供了新的方法。
图7 miRNA检测和Pap测试鉴定高级宫颈上皮内瘤样病变（CIN）的ROC曲线
研究心得
1. 清晰的研究目标
我们的目标是全面系统筛选和鉴定作为宫颈癌分子标记物的miRNA
2. 选取适合的研究工具
可靠的miRNA芯片平台为我们带来准确的miRNA表达谱分析结果，大大减少了我们后续研究的工作量。更让我们惊喜地是，当后期进行上千例样本的miRNA qPCR验证时，早期芯片实验指示的结果仍然是可靠的。
3. 持续不断的探索
从宫颈癌标记物筛查项目立项到产出六篇累计达四十多分的论文，我们组持续专注，并且不满足于获得一些初步的结果。随着数据的不断积累，研究不断深入，最后获得有价值的研究成果，发表高分文章已是水到渠成的事。
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