解密：乙酰化组学揭示结核杆菌对低氧应激的调控

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景杰编者按：人体最基本的结构与功能单位是细胞，而细胞主要通过蛋白质来执行复杂的任务，延续人体机能。好比打仗需要不同的兵器，蛋白质执行不同的任务需要进行不同的"修饰"，一旦蛋白质"被嫁接"上一种叫"乙酰基"的基团，它就"被修饰"成了乙酰化蛋白质。乙酰化是最重要的可逆蛋白质翻译后修饰（PTM）之一，乙酰化修饰功能主要影响细胞染色体结构或激活核内转录调控因子、调节代谢通路及代谢酶的活性，广泛运用在代谢调控机制研究、神经退行性病理机制、肿瘤等研究领域。

研究背景

肺结核（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mtb）引发的肺部感染性疾病，是严重威胁人类健康的疾病，据统计每年全球因结核病而死亡的人数多达170余万，甚至超过AIDS的死亡人数（100万）。Mtb之所以能成为威胁人类健康的病原体因其具有显著的表型耐药性和逃避宿主免疫系统的能力，同时Mtb也可以以休眠状态（非复制状态）在人体内持续存在一段时间而不引起结核病，称为潜伏性结核病感染（LTBI）[1]。因此对LTBI的研究可能成为研究预防结核病药物及治愈处于处于休眠期感染者的切入点。

适应缺氧已被认为在结核杆菌的休眠中起着重要作用[2]。由此，Schubert等对休眠Mtb的蛋白质组进行了描述，并观察到休眠期间应激诱导的休眠存活调节因子DosR约占细胞蛋白质含量的20％[3]。考虑到赖氨酸乙酰化的广泛调节作用，推测赖氨酸乙酰化可能参与缺氧适应机制中。因此，同济大学医学院戈宝学教授与景杰生物合作通过修饰蛋白质组学，对缺氧反应下Mtb蛋白质乙酰化进行相对定量分析，研究结果表明在 269个蛋白质中发现了377个乙酰化位点显著改变，并证实了DosR的赖氨酸乙酰化及其对缺氧反应中的作用[4]。该研究发表在著名的学术期刊Emerging Microbes & Infections。

关键词

乙酰化蛋白质组学、肺结核、低氧反应、DosR、LBTI、结核分枝杆菌

研究思路和成果

首先，研究者利用乙酰化定量蛋白质组学方法，对处于指数生长期和低氧诱导导致的休眠期的结核分枝杆菌（Mtb H₃₇Rv）的赖氨酸乙酰化差异进行相对定量分析。研究者挑选培养了12天的指数生长期和低氧下的菌株，特异性抗体富集乙酰化多肽后采用LC-MS/MS进行乙酰化分析（图1 a）。研究共定量到497个蛋白包含852个位点，其中215个上调蛋白中包含321个乙酰化位点，54个下调蛋白包含56个乙酰化位点。GO功能聚类分析表明，低氧条件下，上调的乙酰化蛋白主要与新成代及谢脂类代谢有关（图1 b c），并参与了黄素腺嘌呤二核苷酸结合，氧化还原酶活性和辅酶结合等分子功能(图 1 d)。

 图1. 低氧条件下结核杆菌Mtb乙酰化分析

KEGG代谢通路分析显示低氧条件下上调的乙酰化蛋白集中碳代谢、RNA降解和丙酸代谢等途径中，而有氧条件下乙酰化蛋白主要存在与核糖体中（图 2 e）。研究表明DosR蛋白在结核分枝杆菌在低氧适应性上起着重要的作用，该蛋白上的K182位点具有重要功能，序列比对结果显示在不同的分枝杆菌中DosR蛋白的K182位点具有高度的保守性（图 2g）。蛋白定量结果显示在低氧可以减少DosR的K182位点的乙酰化，WB实验结果验证了DosR蛋白通过K182位点的去乙酰化的来适应低氧条件（图2h）。以上结果证实了赖氨酸乙酰化修饰在结核杆菌的低氧应激中扮演着重要的角色。

 图2. KEGG通路富集分析及WB验证

接下来，研究者在前面的研究基础上，通过构建重组菌株M. smegmatis及突变菌，对比野生型菌株，检测去乙酰化对细菌低氧适应性的影响。首先研究者构建了脱乙酰重组菌M. smegmatis即采用精氨酸（R）取代会发生乙酰化的赖氨酸(K)，模拟非乙酰化的形式，与野生型（WT）一起置于正常条件及低氧条件下培养，发现DosR蛋白的 K182R和SigA 蛋白的K334R位点突变对低氧下的菌株生长具有显著影响（图 3a, b）。进一步利用H₃₇Rv菌构建了DosR蛋白缺失突变菌株（H₃₇Rv:ΔdosR）及K182R脱乙酰化突变菌株（H₃₇Rv:ΔdosR::dosR^K182R），将构建的突变菌株与WT（H₃₇Rv:ΔdosR::dosR）共同置于正常和低氧两种条件下培养，结果和M. smegmatis重组菌结果一致：脱乙酰化突变菌株对正常条件的生长没有影响，但显著促进了对低氧胁迫的反应（图 c, d），这表明DosR K182的乙酰化直接调节Mtb对缺氧的适应。

图3. DosR蛋白的去乙酰化促进了Mtb的缺氧适应

接下来研究者对低氧条件下目标基因的表达水平进行检测，来确定DosR的靶标基因。研究者在低氧的条件下培养H37Rv:ΔdosR、WT 、H37Rv:ΔdosR::dosR^K182R，随后检测了acr、dosR、fdxA、Rv1738、 Rv2030、Rv2623、 Rv2626c及 Rv3130c的表达水平。结果显示在DosR蛋白K182位点脱乙酰化突变菌株中，这些基因均表现为显著上调(图4h-l)，进一步的EMSA结果显示K182Q几乎没有DNA结合能力，而K182R的DNA结合能力与WT相近（图4m）。因此，K182位点残基对DosR蛋白与DNA结合能力、DosR蛋白下游靶标基因的转录及结核分枝杆菌低氧条件下的生长具有重要作用。

图4. K182R突变体促进DosR靶标基因的转录

研究表明基因Rv0998催化很多重要的蛋白质的乙酰化，为了验证其是否催化DosR K182位点的乙酰化，本文构建了结核杆菌Mtb的Rv0998缺失突变菌株。WB结果显示该突变菌株中DosR蛋白K182位点的乙酰化水平显著降低（图 5a）。进一步结果显示Rv0998能在无cAMP条件下体外乙酰化DosR K812位点（图5b），也能乙酰化DosR K182-pep多肽（图 5c）。Rv0998突变可以显著促进结核分枝杆菌对低氧胁迫的反应并活化DosR靶标基因的转录，如acr, dosR, fdxA（图 5e-g）。

 图5 Rv0998催化DosR乙酰化并活化DosR靶标基因acr (e), dosR (f), fdxA (g) 的转录

总结

结核分枝杆菌感染导致的肺结核仍是全球性的公众健康问题。目前，结核分枝杆菌对低氧胁迫的调控机制尚不清楚。同济大学医学院戈宝学教授课题组，结合乙酰化定量组学技术对结核分枝杆菌应对低氧胁迫的机制展开研究。结果显示低氧诱导了休眠存活调节因子DosR蛋白的去乙酰化，提高了其DNA结合能力进而促进了对靶标基因的转录，最终使结核分枝杆菌向休眠状态转变。揭示了蛋白质翻译后修饰在病原菌对环境应答中的重要作用。

参考文献

[1]. Kurthkoti, K. et al. (2017) The capacity of Mycobacterium tuberculosis to survive ironm starvation might enable it to persist in iron-deprived microenvironments of human granulomas. MBio 8, e01092–17. 

[2]. Peddireddy, V. et al. (2017) Mycobacterial dormancy systems and host responses in tuberculosis. Front Immunol. 8, 84.

[3]. Schubert, O. T. et al. (2015)Absolute proteome composition and dynamics during dormancy and resuscitation of Mycobacterium tuberculosis. Cell Host Microbe 18, 96–108.

[4]. Yang Hua, et al. (2018) Lysine acetylation of DosR regulates the hypoxia response of Mycobacterium tuberculosis. Emerging Microbes & Infections 7(1), 34.

延伸阅读

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。