EMBO:蛋白组学破解乳腺癌药物Palbociclib引起衰老之谜
众所周知,在癌症治疗中,靶向药物具有特异性好、毒副作用少的特点,在临床治疗中发挥重要作用。然而,肿瘤对靶向药物耐药性的产生却是临床实践中遇到的一大难题。在此背景下,如何全面系统地理解耐药性产生的机理是当前癌症研究的热点之一。因此,越来越多的研究运用高通量蛋白质组学分析,以一种较为全面且新颖的视角去重新审视各种生理或病理过程。
二甲双胍为双胍类口服降血糖药,是治疗II型糖尿病常用的处方药。研究发现二甲双胍除了具有降低血糖的作用,还能降低乳腺癌等癌症的发生率,在癌症治疗上具有重要的临床的意义。2016年,德国马普生物化学研究所和罗马大学研究人员合作,在使用二甲双胍处理乳腺癌细胞系MCF-7之后,利用高通量蛋白质组学和磷酸化修饰组学技术揭示了mTOR信号通路在二甲双胍抑制癌细胞生长过程中的重要作用,此研究成果发表在国际著名期刊Cell Systems[1]。
2017年,德国慕尼黑理工大学的研究者在国际著名期刊Cancer Research发表论文,综合分析拉帕替尼敏感和耐药乳腺癌细胞系中的蛋白质组和磷酸化组的变化,揭示了AKT信号通路、糖酵解过程等可能和抗药性的产生有关,并为拉帕替尼耐药性癌症的治疗提供了新的思路[2]。
1、为确定Palbociclib诱导衰老的分子机制,研究者首先采用TMT10plex标记方法,对Palbociclib处理的MCF7乳腺癌细胞进行高通量蛋白质组学分析。结果共定量5515个蛋白,其中3707个蛋白具有高质量热变性曲线。
2、研究者聚焦了195种蛋白激酶进行热蛋白组学分析,以进一步研究Palbociclib如何影响蛋白的热稳定性。结果表明Palbociclib可显著增加其主要靶点CDK4和CDK6的热稳定性,以及CDK6的底物磷酸果糖激酶PFKL等。相反,Palbociclib显著降低了CDK7 和AKT1等激酶的热稳定性。(图1)
图1 Palbociclib 诱导的MCF7乳腺癌细胞热蛋白组学分析
3、接下来研究者对细胞内蛋白质复合体进行了分析,发现Palbociclib显著影响蛋白酶体和mTORC2复合体的动态变化。进一步的分析发现Palbociclib增强了20S蛋白酶体的热稳定性。通过酶活性检测等方法证实Palbociclib可引起蛋白酶体活性增加,即增加相应蛋白的降解。(图2)
图2 Palbociclib 诱导蛋白酶体活性增加
4、为探究蛋白酶体降解机制,研究者通过WB实验与靶向蛋白组学分析(PRM,平行反应监测质谱法)展开分析。WB实验证实Palbociclib 降低MCF7细胞整体泛素化蛋白,但此时20S蛋白酶体的表达了不受影响。PRM定量分析揭示K63、K48、K6、K29泛素支链表达显著降低。总之,以上结果说明了Palbociclib 并不是通过激活泛素化系统来促进蛋白酶体的降解活性(如图3)。另一方面,研究者也采用体外酶活性测试、CDK4/6敲降等方法证实Palbociclib与蛋白酶体活性之间不存在直接相互作用。
图3 Palbociclib 并未通过泛素系统激活蛋白酶体
5、通过免疫共沉淀和质谱分析发现Palbociclib诱导ECM29(蛋白酶体支架蛋白)的表达量显著降低。ECM29敲除之后会显著降低蛋白酶体活性,同时Palbociclib也无法进一步提高蛋白酶体的活性。表明Palbociclib是通过降低ECM29的表达量进而激活20S蛋白酶体的活性。
6、最后研究者对ECM29的功能进行了研究,发现其不仅介导Palbociclib诱导的蛋白酶体激活,对细胞早衰起重要作用,并且可能作为Palbociclib治疗乳腺癌疗效的生物标志物。(如图4)
图4 ECM29可作为Palbociclib治疗乳腺癌疗效的生物标志物
研究者通过对蛋白质组学技术的组合运用,解决了治疗乳腺癌一线药物Palbociclib引起衰老作用机制这一悬而未决的难题。
(1) 首先通过高通量蛋白质组学分析揭示Palbociclib诱导20S蛋白酶体热稳定增加,活性增强。
(2) 采用靶向蛋白组学PRM分析揭示K63、K48、K6、K29泛素支链表达显著降低,这表明 Palbociclib不是通过激活泛素化系而促进蛋白酶体活性。
(3) 最后,研究者利用蛋白免疫共沉淀和及质谱分析最终确认ECM29在Palbociclib-20S蛋白酶体激活过程的重要作用。
研究不仅阐明了palbociclib引起衰老的作用机制,也揭示ECM29可能作为palbociclib治疗乳腺癌疗效的生物标志物,这为临床治疗和精准药物研发指明了方向。
参考文献:
1.Sacco, F., et al., Deep proteomics of breast cancer cells reveals that metformin rewires signaling networks away from a pro-growth state. Cell Syst., 2016. 2(3): p. 159-71.
2.Ruprecht, B., et al., Lapatinib resistance in breast cancer cells is accompanied by phosphorylation-mediated reprogramming of glycolysis. Cancer Res., 2017. 77(8): p. 1842-1853.
3.Miettinen, T.P., et al., Thermal proteome profiling of breast cancer cells reveals proteasomal activation by CDK4/6 inhibitor palbociclib. EMBO J., 2018.
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