不舍昼夜---泛素化修饰与昼夜节律调控机制
生物体所处的环境处于时刻的变化中，在漫长的演化过程中，生物体内形成了昼夜节律机制，以帮助生物个体调整其生理功能以适应外界环境的变化。因为昼夜节律研究的重大科学价值， 2017年的诺贝尔生理医学界授予研究节律的三位科学家。最早的昼夜节律研究主要集中在基因的转录调控机制上，然而随着研究的深入，越来越多的研究结果表明，蛋白质水平的调控，尤其是蛋白质翻译后调控（如泛素化）对昼夜节律的调控起到了不可忽视的作用。
近日，利用泛素化组学对昼夜节律的研究再获突破，来自法国的科学家运用蛋白质修饰组学等技术，揭示果蝇中核孔复合体蛋白MTOR受到周期性的泛素化的调控，在昼夜节律分子振荡器的反馈系统中扮演了重要作用，该研究发表在Cell的子刊Cell Reports上。
众所周知，生物的周期性节律依赖于转录和转录后修饰。之前对生物节律的研究主要集中在mRNA水平上，但是有近50%的与节律相关的蛋白水平变化并不能根据相应基因的转录水平的变化来解释，这就暗示了节律蛋白同时受到了蛋白合成和降解的共同调控。过去对肝脏节律的研究已经发现了很多磷酸化和乙酰化对节律蛋白的调节作用，但是对于调节蛋白降解的泛素化作用，并没有针对于节律蛋白进行过研究。
1. 泛素化修饰谱分析，鉴定节律相关的差异蛋白
为了回答这个问题，研究者首先基于泛素化组学的方法，对处于不同时间节点的样本进行泛素化修饰谱分析。在鉴定到的300多个蛋白中，能够看出不同的时间节点之间的泛素化修饰的差异蛋白有52个（图1 A）。在这些差异蛋白中，一个核孔复合物蛋白MTOR随着时间点的变化尤其显著，该蛋白的丰度在午夜时达到顶峰，并在中午时降至最低（图1 B）。
图1核孔复合物蛋白MTOR随时间变化差异显著
2. 泛素化蛋白的动态调控分析
接下来，研究者对在节律调节中被泛素化调节的蛋白进行了研究，其中76%的蛋白在清晨（6点）时蛋白水平达到顶峰（图2.A），83%的泛素化蛋白在一个周期中的蛋白量变化量超过两倍，平均变化水平为1.7倍（图2.B）。
图2 泛素化蛋白的动态调控分析
3. 实验验证MTOR被泛素化修饰后的蛋白水平的变化及功能探究
利用MTOR泛素化特异性抗体，研究者通过WB实验验证了一天中的不同时间点，MTOR的泛素化程度是受到调控的（图3.A）。而为了研究这种调控对节律有什么影响，研究者利用RNAi的技术敲除MTOR，在没有时间指示的实验条件下，观察到了不仅个体层面上的节律周期从23.5小时延长到了26.5小时，其夜间的活动模式也发生了显著变化，并在10日后果蝇发生了严重的节律混乱（图3.B）。
图3 实验验证MTOR的节律调控功能
4、机理研究发现MTOR的泛素化影响昼夜节律的分子机制
研究者先利用RNAi敲除MTOR，通过分析比较果蝇节律中扮演重要作用的蛋白——TIM和PER在不同时间节点的蛋白水平，来探究其影响昼夜节律的分子机制。研究发现午夜时分，TIM和PER的表达水平有非常显著的提升，早上TIM和PER的降解速度也变慢。结果表明MTOR通过影响下游的TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，进而控制果蝇节律。
图4 MTOR的泛素化影响昼夜节律的分子机制
研究者运用泛素化组学的技术方法，揭示了泛素化这种调控蛋白质降解的翻译后修饰是如何影响果蝇的节律。
（1） 泛素化修饰谱分析发现，MTOR在不同的时间节点差异显著，其泛素化程度受到严格的调控，并影响其蛋白量。
（2） 当敲除MTOR蛋白时，果蝇的节律周期在没有时间指示的情况下被迫延长，并在10天后无法保持节律。
（3） 机理研究发现MTOR通过影响下游的TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，进而控制果蝇节律。
参考文献
Aron Szabo, et al., (2018), Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle, Cell Reports.
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