Cell重磅！蛋白质组学揭示乙酰转移酶p300底物动态变化

蛋白组学·2018线上文献阅读大赛参赛作品06号

时间：2018.6.1-2018.7.30日

参赛方式：参赛者可自行选择一篇2018年见刊的与蛋白质组学研究相关的学术论文（可选择CNS及其子刊或其他10分以上的专业期刊，基础研究、临床、综述均可），对文献进行理解、阐述，形成一篇文献阅读文章。

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编者按

CBP和p300作为经典的酰基转移酶，可催化包括乙酰化在内的多种酰基化修饰，通过对转录因子、组蛋白等核蛋白的乙酰化调控基因的表达。最近，欧洲的研究人员在著名学术期刊Cell上发表体内乙酰化蛋白受酰基转移酶p300动态调控的结果，结合化学遗传学（CBP / p300催化功能抑制剂，bromodomain抑制剂）和经典遗传学（基因敲除）的方法，利用SILAC定量蛋白质组学，揭示了受CBP/p300调控的乙酰化修饰位点的动态变化，为我们理解蛋白乙酰化精细调控提供了第一手的资料。 

1研究背景

赖氨酸N-乙酰化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰（PTM），调节多种细胞过程，其调节异常与癌症和多种疾病高度相关。运用基于质谱的蛋白质组学技术，人类已经成功鉴定数千个乙酰化位点，然而，对乙酰基团的系统理解仍受到两方面限制：（1）绝大多数赖氨酸乙酰转移酶（KAT）与其特异性催化的乙酰化位点缺乏对应关系;（2）乙酰化位点的特异性时间动力学。体内乙酰化修饰有两类：一类是依赖于乙酰基转移酶的酶促反应，还有一类是不依赖酶催化的非酶促反应，因此迫切需要将酶调控位点与非酶促乙酰化分开，建立“酶—底物”的对应关系，同时全面了解位点特异性乙酰化动力学，以获得对乙酰基团的功能理解[1]。这方面的一个主要瓶颈是缺乏特异的KAT抑制剂，可用于识别KAT的体内底物。

CBP和p300具有高度序列同源性和功能相似性，之前的研究手段主要是通过过表达、基因敲低/敲除或体外测定找到其作用底物。然而，由于其他与CBP/p300功能相似的KAT存在，尚不清楚所有鉴定的位点是否由CBP / p300在体内直接催化乙酰化。CBP / p300的敲低/敲除使其同时失去了乙酰基结合的Bromo结构域，很难区分底物乙酰化和转录调控中具体作用结构。近期发现的CBP/p300催化抑制剂[2-3]，为后续系统研究铺平道路。

2研究速读

研究者使用基因敲除 (KO)，CBP/p300 KAT抑制剂Cmpd-R和A-485，以及bromodomain抑制剂（CBP112）分别处理小鼠MEF细胞。利用SILAC标记的方法，结合转录组学，基于质谱的蛋白质组学和乙酰化组学技术，对MEF细胞进行检测（图1A）。共定量了5300个蛋白上的21000个乙酰化位点，每个处理组中均检测到超过3500个蛋白的11500个乙酰化位点（图1B）。

图 1  CBP/p300乙酰化组学图谱

对不同处理组之间的相似性进行对比后我们发现，使用酶活性结构抑制剂（Cmpd-R和A-485）的处理结果与KO组相似性远高于CBP112处理组（图1C），这表明CBP/p300的催化结构域的缺失是KO后乙酰化水平减少的主要原因。

CBP/p300更倾向于催化核蛋白乙酰化，而对细胞质和线粒体蛋白的作用稍弱（图2A）。UniProt关键词检索“Nucleus”相关的蛋白中36％，22％和30％位点分别受KO，Cmpd-R和A-485调控，这表明高达1/3的核蛋白的乙酰化是由CBP / p300催化的。同时CBP/p300的催化位点显着富集于转录和DNA-binding，这与其作为转录辅助因子的作用一致（图2B）。CBP/p300更倾向于催化附近有赖氨酸残基的位点（图2C）。

图 2  CBP/p300乙酰化定量组学分析

在CBP/p300的非组蛋白底物中，发现的转录因子超过200种，包括不同信号通路中的效应蛋白，Bcl9l-wnt增强体相关蛋白，并在增强子驱动的基因表达过程中，调控相关蛋白/蛋白复合体的乙酰化从而对转录活性进行调节（图3C）。

图3 CBP / p300的非组蛋白底物参与转录活性调节

从组学的视角对发生赖氨酸乙酰化的位点进行动态检测，仍是一个难题。这里作者利用基于SILAC的定量MS，定量研究A-485处理后不同时间点的乙酰化水平。CBP / p300调节位点的乙酰化水平与处理时长呈正相关（图4A-C）。随后计算了乙酰化发生的半衰期（图4D）和KDAC去乙酰化的半衰期（图4E）。我们用ACI表示乙酰化的定量水平，结果显示，ACI水平较高，其去乙酰化的半衰期也较短（<30min），这表明CBP/p300作用力最强的位点也是HDAC作用最强的位点（图4G）。研究人员首次展示了内源性乙酰化的半衰期，为后续乙酰化作用的深入研究奠定了基础。

图4 CBP / p300乙酰化组学的动力学分析

CBP / p300可催化四种核心组蛋白的乙酰化，对H2B和H3的调控作用最为明显，如H3K18，H3K27，H3K36和N端H2B位点的乙酰化被KO，Cmpd-R/A-485处理后乙酰化水平分别降低了95％-99％，这表明上述位点的乙酰化几乎完全受CBP / p300调控（图5A），而H2A和H4上的乙酰化可能主要受另外的KATs调控。H2B N端的12个位点在A-485处理后发生乙酰化的半衰期小于1小时（图5B）。

接下来， H2B的脱乙酰化反应动力学比较表明，N端位点被迅速去乙酰化，而K20和K23以稍慢的速率脱乙酰化，C端位点完全不受影响（图5C）。乙酰化肽强度的比较显示N端H2B位点是最高强度组蛋白位点之一（图5D），以上结果首次提供了基于MS的哺乳动物细胞中CBP / p300调节的组蛋白位点的定量图谱，证明CBP / p300的确在体内，以所有四个核心组蛋白为底物催化乙酰化，但是调控程度，特异性和脱乙酰化动力学对于各个位点和组蛋白是不同的。

图5 CBP / p300介导的组蛋白乙酰化

将上述MEF细胞的转录组和定量蛋白组数据进行相关性分析，二者呈现明显的正相关（图6E），这表明CBP/p300对蛋白丰度的影响主要是通过其对于基因转录的调节作用，而排除了诸如泛素化等翻译后修饰的影响。 

图6 CBP / p300对基因转录的调节作用

3小结

研究者通过质谱定量蛋白质组学和乙酰化组学的手段，揭示了CBP/p300的特异性乙酰化催化位点，并绘制了时间动态综合图谱。此研究极大程度地扩展了已知的CBP / p300底物，相关信息已上传至数据库：http://p300db.choudharylab.org，可供查询。

参考文献：

1. Wagner, G.R., et al. (2014). Nonenzymatic protein acylation as a carbon stress regulated by sirtuin deacylases. Mol. Cell 54, 5–16.

2. Lasko, L.M., et al. (2017). Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-spe- cific tumours. Nature 550, 128–132.

3. Michaelides, M.R., et al. (2017). Discovery of spiro oxazolidinediones as selective, orally bioavailable inhibitors of p300/ CBP histone acetyltransferases. ACS Med. Chem. Lett. 9, 28–33.

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