CANCER RES：靶向定量蛋白质组学，揭示黑色素瘤转移“凶手”
景杰生物/解读
研究对象：Ras家族的 Small GTPase
疾病和样本：黑素瘤转移样本
发表期刊：Cancer Research
发表单位：美国加州大学河滨分校
发表时间：2018.08.02
关键词： 靶向定量蛋白质组学；Ras家族 small GTPase；黑色素瘤转移
编者按：Ras家族的小GTP酶（Small GTPase）是细胞内运输的主要调控因子并且参与细胞内各种级联反应信号通路中。有研究显示，小GTP酶的异常表达和肿瘤进程密切相关，包括黑色素瘤中的RHOC和RAB27A。尽管已经有了很多研究报道了小GTP酶参与信号通路和人类疾病过程中，但却鲜有在蛋白质组水平上去定量研究小GTP酶的表达和功能。
本篇文章中，作者选择黑色素瘤这样一个高侵袭性并且具有治疗抵抗的肿瘤进行研究，通过靶向蛋白质组学及后续的机制探究，揭示了Ras家族的小GTP酶RAB38的活化能够促进基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达上调和活化，进而促进黑色素瘤的转移。
文章依赖靶向定量蛋白质组学技术的帮助，不仅解析了病理条件下肿瘤转移的具体机制，更为后续临床上黑色素瘤的诊断和治疗提供指导意义。相关研究发表在国际专业学术期刊Cancer Research上。
小GTP酶在真核生物中非常保守，包括超过100个成员，可以分成六大类：比如Ras，Rho，Rab，Sar1/Arf，Ran和其他分子。要想揭示小GTP酶参与信号通路的机制，必然要先寻找与黑色素瘤转移相关的小GTP酶。
近些年来，靶向蛋白质组学以高特异性和灵敏性特点成为分析目标蛋白和肽段的有力技术手段。因此，作者认为，如果能用靶向蛋白质组学技术，可以让我们更好的认识小GTP酶参与信号通路的机制并能帮助发现病理条件下的新功能。
因此，研究者基于已有的研究，利用SILAC标记定量，SDS-PAGE分离和LC-MRM分析，在三对原发性和转移的黑色素瘤中，靶向定量小GTP酶并分析其表达差异，寻找黑色素瘤转移相关的小GTP酶。
图1.靶向蛋白质组研究策略
1.靶向定量蛋白质组，寻找黑色素瘤转移相关的小GTP酶
研究者通过高通量，靶向定量蛋白质组策略联合细胞培养稳定同位素标记技术对黑色素瘤细胞进行检测，定量分析100个左右小GTP酶，寻找促进或者抑制黑色素瘤转移的小GTP酶。
已有研究显示，RAB27A这个小GTP酶被报道能通过调控MET网络促进黑色素瘤的转移。通过对质谱结果进行分析结合Western blotting验证，作者发现RAB27A确实在黑色素瘤样本中显著高表达，提示其参与黑色素瘤转移过程。同时，分析和验证结果发现小GTP酶RAB38同样在转移的黑色素瘤中高表达。总之，转移肿瘤中小GTP酶RAB27A和RAB38表达上调。
图2.RAB27A和RAB38在转移的黑色素瘤中高表达
2.RAB38促进黑色素瘤的转移
已有文章报道和临床数据库分析结果显示，RAB38这个小GTP酶在多种转移性黑色素瘤细胞系中高表达且与肿瘤患者生存率呈显著负相关。为了进一步探究具体机制，作者选取RAB38进行研究。
通过一系列的转移和侵袭实验包括Transwell实验和Matrigel依赖的入侵实验并对结果进行定量，作者发现过表达RAB38促进转移，敲低RAB38抑制转移，这就说明RAB38确实参与黑色素瘤的转移过程。
图3. RAB38促进黑色素瘤的转移
3.RAB38通过上调基质金属蛋白酶促进黑色素瘤转移
基质金属蛋白酶（MMPs），是一类金属锌和钙依赖的蛋白酶家族，能够降解细胞外基质（ECM）并在肿瘤侵袭过程中发挥关键功能。作者接下来进一步探究RAB38是否对基质金属蛋白酶家族成员的表达和酶活有影响。
实验结果显示：RAB38敲低减少MMP2和MMP9的表达并且降低二者的酶活。同时，过表达RAB38促进MMP2和MMP9的表达和酶活。综上实验结果说明 RAB38通过调控MMP2和MMP9的表达和酶活进而促进黑色素瘤的转移。
图4. RAB38通过上调基质金属蛋白酶促进黑色素瘤转移
4.转移的黑色素瘤中MITF通过转录上调RAB38
以上的实验结果显示，转移的黑色素瘤细胞中，小GTP酶家族成员RAB38表达上调，并通过上调基质金属蛋白酶MMP2和MMP9促进黑色素瘤的转移。那和原发性的肿瘤细胞相比，转移的黑色素瘤细胞中RAB38是通过什么机制表达上调的呢？
已有研究显示微小眼相关转录因子 (MITF)可能参与到RAB38的表达上调过程中。作者通过临床数据库分析和实验发现，MITF通过转录上调RAB38的表达进而促进黑色素瘤的转移。
图5. 转移的黑色素瘤中MITF通过转录上调RAB38
小GTP酶信号的异常往往与多种疾病的发生发展密切相关尤其是肿瘤。本文通过高通量，多通道反应监测依赖的技术策略联合细胞培养稳定同位素标记技术对黑色素瘤细胞进行检测，定量分析100个左右小GTP酶。后续整合TCGA等公共数据库以及实验结果进行生信分析发现，RAB38这个蛋白能够促进肿瘤转移。进一步机制探究揭示，和原发性肿瘤细胞相比，转移的肿瘤细胞其RAB38 基因的启动子甲基化减弱，和转录因子MITF的结合更强进而促进RAB38蛋白的表达。RAB38可以通过调控基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达和活性来促进肿瘤细胞的侵袭。
本篇研究通过靶向蛋白质组学及后续的生信分析、机制探究，揭示了Ras家族的小GTP酶RAB38的活化能够促进黑色素瘤的转移，为后续临床上黑色素瘤的诊断和治疗提供指导意义。
参考文献：
Ming Huang, et al. (2018), A targeted quantitative proteomic approach assesses the reprogramming of small GTPases during melanoma metastasis. Cancer research.
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