Cell Systems：多组学分析揭示干细胞多潜能分期进展的动力学
景杰学术/解读
多潜能性(pluripotency)是指高等植物细胞，在伴随胚胎发育的同时逐渐丧失了发育成个体的能力，仅具有分化成有限细胞类型以及构建组织的潜能的特性。比如我们熟知的干细胞就是一种具有多潜能性的细胞。近日，美国国立卫生研究院的研究人员在国际专业学术期刊Cell Systems上发表了一篇采用多组学的分析方法揭示多潜能分期进展的动力学的文章。
多潜能干细胞是高度动态和持续发展的，多潜能性的原始态（naive）和始发态（primed）这两种状态在之前已经被深入研究过，但是对两者的中间状态和转换过程知之甚少。在本研究中，研究人员通过研究从原始态到始发态的多潜能性的胚胎干细胞的蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学，转录组学和表观基因组学，综合性地分析了胚胎着床前到着床后胚层分化的多能态转变动力学，结果发现磷酸化蛋白质组学具有快速、急性和广泛变化的特点，且优先于其他三类组学的有序变化。通过本研究，研究人员对潜能性阶段进展的多层控制提出了新的见解，并为调控潜能性状态转变的模型机制奠定了基础。
1. 胚胎干细胞多能性的多组学图谱
为了揭示蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学，转录组学和表观基因组学在从原始态（naive）到始发态（primed）多能性转变过程中的时间动力学，有研究人员使用了一个先前验证过的系统来诱导小鼠原胚胎干细胞（ESCs） 植入上胚层样细胞(EpiLCs)。在由ESC到EpiLCde 72h转变期内，研究人员采用基于质谱的蛋白质组学和磷酸化修饰组学，再结合二代测序技术，对不同时间点进行了检测，从而绘制了蛋白质组学、磷酸化修饰组学、转录组学和表观基因组学的图谱。
值得一提的是，为了提高蛋白质组测定的覆盖率，研究人员采用了基于SCX的StageTip分馏法。此外， 应用EasyPhos技术也获得了不错的磷酸化肽段覆盖度，在单次运行中可定量超过15000个磷酸化肽段。研究再所有的样本中共鉴定到包含有37619个磷酸化位点的30726个磷酸化肽段，其中有超过80%（26180）的可定量磷酸化位点具有高的位点可能性（0.96）。12个不同时间点的多组学分析结果表明，共有17,866个磷酸化位点和超过一半的磷酸化位点（14,103）被定量。研究人员从蛋白质组学的结果中鉴定到超160000条不同的肽段，此外，在所有的样本中有10597个蛋白可定量，在每个样本中有9250个蛋白可定量，综上可以看出蛋白质组学检测具有相当高的覆盖度。
此外，研究人员应用RNA-seq技术绘制了8个时间点的转录组图谱，总检测到16,734个转录本，对应13,600个独特基因。通过从同上8个时间点收集的染色质的免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，鉴定了数千个转录活性与平衡基因。
2. 磷酸化组动力学变化优先于表观基因组，转录组和蛋白质组
为了解改变细胞特性的分子事件顺序和时间动力学，研究人员检测了ESCs多潜能性的多个阶段的蛋白质组学、磷酸化修饰组学，转录组组学和表观基因组，研究这四个组学变化的时间，规模和程度。结果显示磷酸化修饰组动力学先于表观基因组，转录组学和蛋白质组学发生变化。
结果表明约50%受调控的磷酸化位点在EpiLC诱导的15 min内被显著修饰，其中约1/3的磷酸化位点最早在5 min时就发生改变了。相比之下，少于1%的蛋白组或转录组在起始的一小时内显著改变。基因启动子上的H3K4me3水平在EpiLC诱导一小时开始改变，是伴随着转录组平缓和广泛变化发生的表观基因组变化的第一个迹象。转录组在第6 h后显著改变，蛋白质组的广泛变化直到诱导后约12小时才明显展露，这大概是因为与蛋白质合成与成熟的相关潜在因素存在。这些研究数据表明在多能状态转换中信号传导的先驱作用。
图2 ESC到EpiLC转化过程中不同组学的时间动态
在上述基础上，研究人员针对磷酸化位点、转录本和蛋白质动态调节的变化幅度进行了研究。 结果显示蛋白质磷酸化存在最大程度的变化，且变化幅度更为广泛，这表明磷酸化蛋白质组在这种转变过程中比蛋白质组更具动态性。从具体分析mRNA，蛋白质和磷酸化水平受到差异调节的基因中得出，与蛋白质水平显著变化无关的这些受调控的磷酸化位点状态的变化可能会改变蛋白质活性，位置，组成及互作，从而体现出动态磷酸化在多潜能性阶段性进展过程中起关键作用。
3. ERK信号传导分析
为阐明当细胞经过多能性的不同阶段转变时，发生的信号事件、发生的时间和顺序，研究人员结合CLUE算法和激酶注释，鉴定到4个激酶底物（ERK / S6K / RSK，mTOR，p38a和AKT）。随后检测了激酶ERK1和ERK2的磷酸化动力学，结果显示在诱导后约1小时发生快速去磷酸化，这一结果符合MS的磷酸化数据，同时WB实验也证实了ERK1 / 2的瞬时活化，而在蛋白质或mRNA水平上没有发生大的变化。ERK信号受负反馈环严格控制，且ERK1 / 2活性转录诱导特异性ERK1 / 2途径抑制剂，那么在ESCs从navie多潜能性转变时，ERK1 / 2信号传导动力学是否会受到负反馈的影响。为此，研究人员检测了已建立的ERK1 / 2信号传导的负调节因子的表达动力学，结果表明当ESC从基态转变时，ERK1 / 2信号传导可以严格控制负反馈环。
基于ERK1 / 2信号传导的瞬时激活的理论，研究人员提出假设：在EpiLC诱导6小时后ERK1 / 2信号传导可有可无。通过评估naive 和primed多能性因子的表达变化，证实虽然需要ERK信号传导来触发基态naive多能性的退出，但在进入EpiLC诱导约6小时后，它在很大程度上可有可无。
图3 Erk2和Erk1在ESC到EpiLC转换过程中的磷酸化、蛋白质和mRNA三个水平的变化
4. 多能性进展过程中转录组和蛋白质组变化的比较分析
研究人员通过检测mRNA表达和蛋白质丰度的时间动态，来研究信号传导对转录组的下游影响以及ESC到EpiLC转换期间转录水平的变化转化为蛋白质水平的变化。结果表明哺乳动物系统中稳态mRNA和蛋白质水平之间的相关性普遍有限且相当稳定（相关性系数在0.48~0.56）。
随后，研究人员采用GO分析研究了72 h和0 h的蛋白质荷mRNA水平下调的基因，分析出与干细胞维持、胚盘分割和胚胎植入相关的基因的富集。而上调的基因富集到了在发育和甲基化依赖性染色质沉默中起作用的基因。根据蛋白质和mRNA水平变化倍数的程度显示：动态调控基因有Esrrb，Tfcp211，Nanog，Sox2，Klf2 / 4，Tbx3和Kdm3a / b，这些基因与naive多潜能态相关，并且与移植后的上皮细胞Otx2，Dnmt3a / b等在转录组和蛋白质水平变化间展现出强烈的相关性（R>0.85）。Prdm14m的RNA水平变化很大但蛋白质水平却没有，与RNA-seq，MS蛋白组质组学及qRT-PCR结果一致。
图4 基于mRNA和蛋白质水平变化程度的基因排列顺序
综上所述，文章综合性地分析了多潜能性胚胎干细胞分期进程中的蛋白质组、磷酸化蛋白组、转录组和表观基因组，发现磷酸化蛋白质组动力学变化优先于表观基因组，转录组和蛋白质组，在一定程度上为调控多能性转变的分子机制研究提供理论基础，同时也为生物分化进程中的多层调控研究提供了新的思路与框架。
参考文献：
Yang P, et al., 2019, Multi-Omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell systems.
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