重磅！Matthias Mann发文，基于捕获离子淌度的新一代4D 蛋白质组学
景杰学术/报道
蛋白质组学技术的进步推动了生命科学和医学领域的快速发展，但传统的蛋白质组学技术仍面临着检测通量和定量稳定性等方面的诸多挑战，而这些挑战终于在近期迎来了方法学上的重大突破。
2018年12月蛋白质组学领域顶级期刊MCP在线发表了德国马普生化研究所所长、世界著名蛋白质组学专家Matthias Mann教授最新的研究成果。该文章介绍了基于PASEF的timsTOF Pro质谱系统，该质谱采用了捕获离子淌度(TIMS)技术，能实现更快速度、更高灵敏度、更强大的4D蛋白质组学分析，展现了其在蛋白质组学领域的强大功能和广泛应用前景。
Graphical Abstract
蛋白质组学研究对于理解生理条件下生命过程以及病理条件下疾病发生发展都具有非常重要的意义。Bottom-up蛋白质组学实验流程主要包括前期的样品制备、酶解肽段、色谱分离、质谱检测、生信分析。在质谱检测过程中，由于蛋白质组的复杂程度极高，而仪器的扫描速度有限，因此只能选择相对强信号的离子进行检测，但这个过程存在一定的随机性并且会影响后续鉴定的蛋白通量。
尽管有研究表明在哺乳动物蛋白组研究上能够实现蛋白组的深度覆盖，但这个过程需要耗费大量的实验投入包括样品制备和检测时间。同时，色谱分离中的共洗脱肽段也进一步加大了分析的难度，也使得许多低丰度蛋白信号被掩盖而无法检出。和基因组以及转录组技术相比，蛋白质组技术由于质谱扫描速度、灵敏度、通量等因素的限制导致其应用场景仍然受限。在过去的十几年里，也正是因为这些技术的不足推动着质谱系统在速度和灵敏度上的不断革新。
本篇研究介绍的就是近期取得重大突破的timsTOF Pro质谱系统，其所采用的PASEF技术在采集速度倍增的基础上仍然保持高分辨率。而基于此衍生出的4D蛋白质组学方法，在不借助Spectral library的情况下，单针即可从极微量样品中鉴定到超过6000个蛋白，因此特别适用于快速且高灵敏的蛋白质组学检测，并为蛋白质组学技术在基础研究和临床转化方面的应用带来了全新的可能。
捕获离子淌度(TIMS)指的是在保留时间( retention time)、质荷比(m/z)分离的基础之上增加了离子淌度( ion mobility)新维度的分离，加上离子强度(intensity)构成了“4D蛋白质组学”的四个维度。其中新引入的离子淌度，主要是根据分子的形状和截面进行分离，能够有效降低“混合谱图”的比例。
Matthias Mann教授组结合一定的算法对肽段离子从m/z以及Ion mobility两个维度进行分析鉴定。从结果中我们可以看到，在m/z维度上不能分离的肽段离子在新增的离子淌度维度上能够被清晰的分离（图1）。
研究中同时介绍了另一种新的技术应用，即同步累积连续碎裂PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation）技术（图2）。基于timsTOF Pro运用的双TIMS分离/富集装置，离子在第一个TIMS部分中进行累积，然后在第二个TIMS中根据淌度进行分离，经过分离后的离子继续用于MS/MS碎裂。随后重复该步骤，在该过程中，当第二个TIMS进行分离时，第一个TIMS也同时在平行地累积离子，这样可以实现近乎100％的离子利用率。
图2. TimsTOF Pro上实现同步累积连续碎裂（PASEF）
在蛋白质组学研究中，一个关键的步骤就是对不同生物学重复样本之间蛋白丰度进行准确定量，即所谓的“质控标准”。为了进一步分析timsTOF Pro对蛋白定量的准确性，研究者从皮尔森相关系数（Pearson correlation coefficient）、中位数变异系数（median coefficients of variation）、缺失值（missing value）和定量准确度（quantitative accuracy）这四个统计角度进行分析。在2h、四次重复的条件下平均鉴定到5575个蛋白，重复性分析结果显示皮尔森相关系数为0.979，表明实验的重复性非常好（图3A）。MaxLFQ归一化以后，中位数变异系数为7.2%（图3B）。
进一步，研究者发现PASEF技术能够显著降低label-free缺失值的问题（图3C）。为了进一步验证timsTOF Pro定量准确性，研究者将Hela和大肠杆菌胰酶消化后的肽段混合并进行质谱分析，结果显示95%的蛋白是能准确定位的，只有1.3%的蛋白被错误分类。展示了该方法高水平的定量准确性（图3D）。
为了验证tims-TOF蛋白组定量检测速度和通量，研究者采用了100ng、50ng、10ng的Hela细胞样品并在1h、0.5h条件下进行实验。结果显示，100ng、50ng、10ng的样品量在1h的条件下分别可以鉴定到4513、4215、2723个蛋白。30分钟内10ng的Hela细胞能够鉴定到2100个蛋白，而适当增大样品量和梯度时间则可实现单针检测超过6000个蛋白。这个结果表明TIMS-PASEF非常适用于快速且高灵敏度的蛋白质组学应用。
在这篇文章中，研究者介绍了整合了四级杆飞行时间、捕获离子淌度（tims）以及同步累积连续碎裂（PASEF）扫描模式的全新质谱技术。Bruker timsTOF Pro以强大而灵活的方式成功地整合了这些模块，不仅实现了基于PASEF操作的shotgun蛋白质组学，也使得许多其他操作模式的探索成为可能。
基于此衍生出的4D蛋白质组学，为蛋白质组学定量的准确性和灵敏度带来了革命性提升，并且极大的减少检测时间和样品量。本篇研究中，30分钟内10ng的Hela细胞能够鉴定到2100个蛋白，而适当增大样品量和梯度时间则可实现单针检测超过6000个蛋白。在提高扫描速度的同时，MS和MS/MS谱图依然保持超高分辨率，这些独特的性能，使其成为蛋白组学复杂样本深入研究的利器。
基于新一代4D蛋白质组学，研究者将能够对复杂样品的分子机制进行更深入的研究、提高发现低丰度生物学重要蛋白质的可能性，并在转化医学、临床蛋白质组学等研究中具有广泛的应用前景，也标志着蛋白质组学正式进入“4D 新时代”。
参考文献
Florian Meier, et al., 2018, Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics.
本文由景杰学术团队原创，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿、等其他合作需求，请添加微信ptm-market咨询。
往期精彩回顾
专家视界01：秦钧:透过水晶球看2019年的蛋白组学
专家视界02：上海生物信息技术研究中心谢鹭教授：用蛋白质组学破译癌症密码
专家视界03：南开大学张晓东教授：解析乙肝致癌机制的”津门神探“
专家视界04：山东农业大学王勇教授：从基因到蛋白，全面深入阐述硝态氮调控机制
专家评述01：李兰娟院士团队开发慢加急性肝衰竭精准诊断蛋白标志物组合
专家评述02：河南农业大学范国强组首次揭示翻译后修饰介导毛泡桐丛枝病发病新机制
精选08-糖基化：破译“糖代码”，糖基化修饰研究近期精选
精选07-外泌体：多篇文章解读外泌体蛋白质组学的重要研究成果