专家评述 | 河南农业大学范国强组首次揭示翻译后修饰介导毛泡桐丛枝病发病新机制
解读：景杰学术
评述：范国强 教授 （河南农业大学）
编者按：近日蛋白质组学Top期刊MCP上发表河南农业大学范国强教授课题组最新成果，研究通过对植原体感染的毛泡桐进行了乙酰化修饰组学和琥珀酰化修饰组学分析，首次从蛋白质翻译后修饰的角度阐述丛枝病的发生机理。研究对植物/病原菌互作研究有较好的参考价值，我们有幸邀请到文章通讯作者范国强教授分享开展研究的思路与科研价值，欢迎关注。
泡桐树原产于我国，迄今已有超过2000年栽培历史，既有很高的园林观赏价值，又可用以制作家具、乐器等实现经济价值。由植原体侵染所引起的丛枝病是泡桐树分布最广泛的一种病害，它可以直接导致泡桐的死亡，从而造成严重的经济损失。植原体是一类不具有细胞壁的原核生物,属硬壁菌门(Firmicutes), 柔膜菌纲(Mollicutes), 由于缺乏侵染泡桐的植原体基因组信息，关于侵染过程的病原菌-寄主互作机制研究较为缺乏。
随着组学技术的发展，越来越多的证据显示在植原体侵染的过程中，泡桐可以通过在转录，翻译，代谢等层面调节体内的代谢过程来实现寄主存活的目的。然而，蛋白质的翻译后修饰是否在这个过程中发挥作用，目前知之甚少。蛋白质的翻译后修饰与植物病理，植物生理等都有密切的关系。尤其赖氨酸乙酰化，琥珀酰化等酰化修饰类型，在代谢过程中发挥重要的调控作用，在植物非生物胁迫/生物胁迫领域都有诸多报道。然而，它们在木本植物中的功能探索却比较缺乏，更不论在木本植物与病原菌互作的领域。
4月1日，河南农业大学范国强教授课题组在蛋白质组学Top期刊Molecular Cellular Proteomics上发表论文，利用基于质谱的高通量蛋白质组学和修饰组学对植原体侵染的毛泡桐幼苗进行了研究，首次揭示了植原体侵染过程中，毛泡桐体内的乙酰化与琥珀酰化修饰水平变化以及它们在毛泡桐丛枝病中所发挥的功能。
研究发现，乙酰化的发生使得一些催化叶绿素和淀粉合成的酶活性受到明显抑制，这揭示了发病过程中叶片黄化等表型的分子机制。虽然乙酰化，琥珀酰化等修饰类型已经在水稻等植物中有了诸多报道，但是在林木中的报道却非常少。本研究从翻译后修饰角度入手，对毛泡桐进行了观测，在木本科植物和病原菌互作领域起到了先创性研究作用。这项研究工作由河南农业大学范国强教授课题组完成，曹亚兵为本文第一作者，景杰生物为该研究的修饰组学定量提供了技术支持。
1、植原体侵染引发淀粉沉淀，光合活性和色素含量降低
作者分别在健康毛泡桐幼苗和植原体侵染的幼苗中测量了淀粉含量，叶绿素含量以及光合作用和羧基化效率，发现随着病原菌侵染，淀粉累积明显，光合活性和色素含量却明显降低（Figure1）。
图1 侵染和健康幼苗中淀粉，色素和光合活力测定
2、植原体侵染改变了毛泡桐体内蛋白和修饰表达水平
研究人员分别选取了健康毛泡桐幼苗（HS），植原体侵染的幼苗（PIS），甲磺酸钾酯处理后的健康幼苗（HS-60）以及甲磺酸钾酯处理后又侵染的幼苗（PIS-60）分别包括三次生物学重复（样本策略），利用TMT技术对四种处理的毛泡桐幼苗进行了蛋白质组学，乙酰化和琥珀酰化修饰组学鉴定（质谱策略）。研究共检测到了8963个蛋白，其中276个蛋白的表达量随着植原体的侵染显著变化，而这些蛋白主要参与到次级代谢物合成，叶绿素代谢等通路当中（Figure2a）。
图2 蛋白质组学和修饰组学结果分析
除此之外，随着丛枝病的发生，2893个蛋白上的5559个乙酰化位点发生变化，1271个蛋白上的1970个琥珀酰化位点发生变化（Figure2b）。由于鉴定到的琥珀酰化蛋白数量明显少于乙酰化蛋白，作者推测在毛泡桐与植原体的互作过程中，乙酰化的作用要高于琥珀酰化。
三、乙酰化影响淀粉和叶绿素合成酶的活性
之前已有研究证明乙酰化的发生会影响一些关键酶的活性，如RuBisCO。此研究中，作者鉴定到了几个催化叶绿素合成，淀粉合成等关键代谢过程的酶随着植原体的侵染发生了乙酰化修饰，比如POR和RuBisCO的大亚基（Figure3a）。并且作者发现，这俩个蛋白上的乙酰化修饰位点都位于蛋白的功能域。为了验证修饰的发生是否影响了这俩个酶的活性，作者对修饰位点进行了点突变（赖氨酸突变为精氨酸或谷氨酰胺）。最终发现，突变明显抑制了POR和RuBisCO大亚基的酶活，从而导致了丛枝病的发生（Figure3b）。
图3 乙酰化修饰影响了POR和RuBisCO大亚基的酶活
综上所述，本文利用基于质谱的高通量蛋白质组学和修饰组学对植原体侵染的毛泡桐幼苗进行了研究，揭示了毛泡桐丛枝病发病过程中蛋白的翻译后修饰发挥的重要作用，在木本科植物和病原菌互作领域起到了先创性研究作用。
专家评述
范国强 （河南农业大学林学院教授，河南农业大学泡桐研究所所长）
1、您这项研究首次揭示了毛泡桐丛枝病发病过程中乙酰化和琥珀酰化发挥的重要作用，能给我们介绍下开展这项研究的意义吗?
泡桐为玄参科泡桐属植物，是我国重要的速生用材、庭院绿化和防护林树种，在防风固沙、改善生态环境等方面发挥着重要作用。泡桐材质优良、纹理美观，即可作为建筑用材、也可用于家具、乐器和工艺品的制造，深受广大人民的喜爱。大量种植泡桐对脱贫攻坚建设美丽乡村具有巨大的经济、生态和社会意义。泡桐丛枝病能导致幼树死亡，大树生长缓慢、蓄积量降低，仅河南每年造成的直接经济损失超过数十亿元人民币，严重影响了我国泡桐产业的发展。
在过去的几十年中有关泡桐丛枝病的研究都集中在生理生化方面，近年来随着测序技术的不断发展，我们对其进行了转录组，miRNA，蛋白质组，代谢组方面的研究，找到了一些与丛枝病发生密切相关的基因，蛋白质和代谢物。但是由于数据量较大，且三者之间的联系较小，因此有关泡桐丛枝病发生的机理并不明确。近期的研究表明，蛋白质翻译后修饰在植物病原菌互作中起到重要作用，且有研究表明病原菌分泌的效应蛋白可能作为修饰转移酶在抑制植物免疫反应中起到重要作用。因此，为探究蛋白质翻译后修饰是否参与了泡桐丛枝病的发生，本研究对植原体感染的毛泡桐进行了乙酰化修饰组学和琥珀酰化修饰组学分析，以期从蛋白质翻译后修饰的角度阐述丛枝病的发生机理。
2、您这篇研究中先是进行了修饰组学研究，最后对发现的修饰位点进行了点突变，在相关研究中很难得，能分享下您开展本研究的思路和看法吗？
利用修饰组学得到的结果只是一个修饰轮廓的描述性结果，只能说明其与丛枝病发生有相关性，并不能确定其与丛枝病结果发生的必然关系。由于在本研究中我们发现与丛枝病症状发生相关的蛋白是个酶，因此，为了证明蛋白质修饰的确与丛枝病的发生有密切的关系，我们需要对发生修饰的蛋白质进行定点突变（模拟发生修饰和不发生修饰），以证明蛋白质的翻译后对酶的活性产生了影响，抑制了相关酶的活性，从而导致了丛枝病的发生。
3、我注意到您研究中鉴定到乙酰化与琥珀酰化的作用，因为鉴定到的琥珀酰化蛋白数量少于乙酰化蛋白，因此后面针对乙酰化蛋白开展了研究。对于其中鉴定到的琥珀酰化蛋白或可能的琥珀酰化调控机制，您有什么看法或者下一步的研究计划？
由于丛枝病症状的发生是个复杂的过程，每个症状的产生可能是由特定的因素引起的，这些因素可能是单个或多个不同的机制共同调控的。在本研究中，我们发现丛枝病发生之后有大量蛋白质的琥珀酰化水平发生变化，但是通过分析我们只找到了5个与丛枝病发生相关的琥珀酰化蛋白质。因此，我们认为那些大量变化的琥珀酰化蛋白质可能是与泡桐适应植原体入侵或生长发育等相关。与此同时，我们还发现许多蛋白质同时发生了乙酰化和琥珀酰化修饰，这些同时发生两种修饰的蛋白质在丛枝病发生过程中有什么特定的作用我们目前并不清楚，后续我们会深入研究这些蛋白质，以揭示其特定的生物学意义。
4. 能给我们分享一下这项研究中的科研故事吗？
是的，这个项目历经坎坷，事实上有些试验我们重复好多次，才拿到理想的结果，这些试验有的历时半年左右。考虑到幼苗培养周期较长，且需要用到试剂进行处理，研究期间遇到样品采集、保存等方面的困难是不言而喻的。同时，该项目在研究期间所用到的质粒是由山东师范大学生命科学学院的陈卓老师提供，在此，要特别感谢陈老师的帮助和支持。
参考文献
Ya bing Cao, et al., 2019, Phytoplasma-inducedchanges in the acetylome and succinylome of Paulownia tomentosaprovide evidence for involvement of acetylated proteins in witches' broom disease. MolecularCellular Proteomics.
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