第一作者解答：水稻赖氨酸巴豆酰化修饰及其对基因转录的调控

景杰生物/报道

生命活动是个动态变化的过程：细胞、组织和器官要时刻适应内部生理条件的改变、外界环境的变化。为了适应这些变化，生命体在基因水平表现为基因的表达调控，在蛋白水平表现为蛋白的翻译后修饰、蛋白质相互作用、蛋白胞内定位的变化。蛋白质翻译后修饰既可以直接影响蛋白功能、稳定性或者蛋白间相互作用，组蛋白的翻译后修饰还可以影响基因表达调控，而巴豆酰化修饰就是众多蛋白质翻译后修饰中杰出的代表之一。

 日前，扬州大学龚志云课题组在蛋白质组学顶级期刊MCP上发表了水稻赖氨酸巴豆酰化修饰的最新成果。利用景杰生物开发的巴豆酰化泛抗体和巴豆酰化组学分析，研究人员发现水稻组蛋白巴豆酰化对基因表达的调控特征，ChIP-seq的结果表明巴豆酰化修饰主要发生在基因外显子区域。除此之外还发现植物特有的叶绿体中，尤其是光合作用中很多蛋白质也发生巴豆酰化修饰，暗示该修饰对光合作用调控起了重要的作用。为此，我们对文章的两位共同第一作者刘帅和薛超，就本研究的背景、研究结果及展望进行了访谈，文后还有本文通讯作者进行的点评，以飨读者。

1第一作者采访内容

Q1：什么是赖氨酸巴豆酰化修饰？目前的研究表明该修饰有什么生物学功能？

赖氨酸巴豆酰化修饰是芝加哥大学赵英明教授实验室2011年在Cell期刊报道的一种新型的翻译后修饰，该修饰是一类从酵母到人类都保守存在的“组蛋白密码”，且主要分布在活跃基因的启动子区域或潜在增强子区域的组蛋白上，参与调控基因表达。随后北京大学张宏权教授团队，于2017年在Cell Research上报道巴豆酰化修饰广泛分布在非组蛋白上，暗示其在表观遗传调控外还具有其他的生物学功能。然而，植物中有关巴豆酰化修饰的研究报道很少，巴豆酰化在植物的生长发育和基因表达过程中是否也起着重要的调控作用仍然是未知的。

Q2：能否简单介绍一下您的课题组以及本研究的思路？

我们导师是扬州大学龚志云老师课题组，主要从事植物染色体分子生物学和表观遗传调控研究。在前期的研究中，我们分别利用IF和Western-Blot技术检测赖氨酸巴豆酰化修饰水稻叶片总蛋白中广泛存在(图1)。接下来我们想了解哪些蛋白质发生了巴豆酰化修饰，修饰位点是哪些？这些发生修饰的蛋白分属于哪些途径？亚细胞定位是什么？解决上述问题需要进行水稻的巴豆酰化蛋白质组学分析。利用巴豆酰化修饰泛抗体(PTM-501，PTM biolabs, Hangzhou)，将水稻日本晴中的巴豆酰化蛋白进行富集，通过串联质谱，鉴定到1265个发生巴豆酰化修饰的肽段，分属于690个蛋白。接下来的生物信息学分析表明，上述蛋白主要参与了蛋白质合成，光合作用以及糖酵解等多种代谢途径。并且，亚细胞定位显示，51%巴豆修饰的蛋白被定位在叶绿体上(图2)，这和中国农科院烟草巴豆酰化修饰蛋白的亚细胞定位的分析一致，他们发现37%巴豆酰化修饰蛋白存在于叶绿体上。因此这表明无论是单子叶植物(水稻)，或是双子叶植物(烟草)中，叶绿体蛋白普遍发生巴豆酰化修饰，并且在叶绿素合成异常的黄化苗中蛋白巴豆酰化修饰水平显著降低(图3)，说明该修饰在植物的光合作用过程中起着重要的的角色。

Q3：可否为我们简单讲解巴豆酰化修饰在水稻基因调控中的作用？

为了进一步了解水稻组蛋白巴豆酰化修饰在染色体上的分布，我们同南京农业大学的吴玉峰教授课题组合作，通过ChIP-seq分析了组蛋白Kcr修饰全基因组DNA序列的特征。结果表明组蛋白巴豆酰化主要富集在基因上尤其是外显子区域，并且富集的丰度与基因的表达量成正比(图4)。并且与已报道的相关组蛋白修饰(H3K9ac, H4K12ac, H3K4me2, H3K36me3 and H3K27me3)在水稻基因组典型区域上的分布相比较，我们发现组蛋白巴豆酰化修饰促进基因表达的分布特征与活性修饰H3K9ac, H4K12ac, H3K4me2和H3K36me3相类似，而与抑制转录的H3K27me3修饰不同(图5)。同时，我们也发现在基因间区，77%巴豆酰化修饰的位点与DHSs(DNase I hypersensitive sites，顺式-调控的DNA元件)重叠。但只有6%的修饰位点与IPA1( ideal plant architecture 1，转录激活子)结合的活性增强子相关，说明组蛋白巴豆酰化可能修饰除IPA1以外的其他顺式作用元件。

Q4：本文关于水稻巴豆酰化的结果有哪些重要的生物学意义？对于未来对未来的研究有哪些启示？

本研究不仅暗示了巴豆酰化修饰与乙酰化、磷酸化等翻译后修饰一样，在植物的生长发育、代谢合成等众多生物学途径中具有重要的调控作用；更关键的是，我们发现组蛋白上的巴豆酰化修饰在基因的表达调控中也是至关重要的。目前，已有研究表明，组蛋白乙酰转移酶同时也可以调控组蛋白巴豆酰化修饰。为此，在接下来的研究工作中我们希望通过对水稻乙酰转移酶的探索，深入解析水稻组蛋白上的巴豆酰化对基因的调控机制及其在水稻生长发育的重要作用。

Q5：在研究过程中课题组遇到哪些问题？又是如何去解决这些问题？

当然，本项目在进行过程中也并非一帆风顺的。其中如Western-blot实验一开始时并不稳定，我们进行反复摸索与尝试，最终获得最适合于水稻蛋白修饰研究的Western-blot实验方法。这对我们的研究经历而言，是个很好的学习的过程。最后，由衷的感谢所有为这篇文章付出努力的老师与同学！同时，也希望一同走在科研之路上的小伙伴们不抛弃、不放弃，努力终归会有收获。

2导师点评

在组蛋白修饰中，赖氨酸巴豆酰化修饰是一种新型的蛋白翻译后修饰方式并首次在哺乳类动物中被发现。近年来越来越多的研究发现该修饰在动物中发挥着与乙酰化修饰同样重要的作用，但在植物中目前报道甚少。另外，水稻作为一种重要的单子叶模式生物及粮食作物，它的组蛋白修饰研究相对滞后，但是随着水稻基因组测序的完成，关于水稻的各种信息的数据库不断的充实，以及生物信息学的快速发展，均为水稻在表观遗传方面的研究奠定基础。基于此，我们选择在水稻中开展赖氨酸巴豆酰化修饰的相关研究。本研究利用WB、IF、LC-MS/MS、ChIP-seq等多种目前组学研究的主流实验技术，并结合生物信息分析，首次成功解析了水稻中蛋白巴豆酰化图谱特征及组蛋白巴豆酰化修饰全基因组DNA序列的特征。相关研究丰富了植物中蛋白修饰的类型，并且为深入开展水稻中新型组蛋白修饰机制提供基础。

通讯作者简介

龚志云 博士照片

教授，博士生导师，现任扬州大学农学院作物遗传育种与应用生物技术系副主任。先后入选教育部霍英东教育基金、江苏省333工程第三层次、江苏省青蓝工程优秀青年骨干教师、扬州大学第二届尖端人才（拔尖人才）等资助与培养对象。曾荣获第15届“挑战杯”全国大学生挑战杯二等奖指导老师、江苏省百篇优秀博士论文、江苏省优秀本科论文指导老师、江苏省第15届大学生挑战杯特等奖指导老师等荣誉称号。主要从事水稻基因组学及表观遗传学等研究工作，先后主持国家自然科学基金、973子项目、江苏省高校自然科学重大基础研究项目、江苏省自然科学基金等项目10余项。在Plant Cell、Mol. Biol. Evol.等期刊上发表论文40余篇，申请发明专利6项。

吴玉峰 博士照片

教授，博士生导师，现任南京农业大学生物信息学中心主任。2008 年于中国科学院遗传与发育生物学研究所获遗传学博士学位。 2008-2012 在美国Wisconsin-Madison大学园艺系从事博士后研究工作。2012.1-2014.6 为该校研究助理(Assistant Scientist)。2014 年6 月加入南京农业大学农学院作物遗传与种质创新国家重点实验室。2015年5月入选中组部第十一批“青年千人计划”。主要从事植物表观基因组学和生物信息学研究，在Plant Cell，Mol. Biol. Evol.等期刊上发表论文约30篇。

图2  水稻中发生巴豆酰化修饰的蛋白亚细胞定位分析，及巴豆酰化修饰肽段的典型质谱图

图3 正常和黄化的水稻幼苗蛋白巴豆酰化水平的变化

图4 ChIP结果表明，水稻组蛋白巴豆酰化主要富集在基因外显子区域 

图5 ChIP结果表明，组蛋白巴豆酰化修饰的peak区与促进基因表达的活性修饰高度重叠

参考文献

Shuai Liu, et al. (2018) Global involvement of lysine crotonylation in protein modification and transcription regulation in rice, Molecular & Cellular Proteomics.

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