洞悉入微，CELL METAB | 磷酸化组学揭示糖尿病的关键致病信号节点
景杰学术/解读
糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种以长期高血糖为主要指标的代谢紊乱综合症，伴随着多种并发症及合并症，其中以2型糖尿病的发病率最高。越来越多的证据显示，胰腺β细胞功能的下降是2型糖尿病发病机制的核心。然而我们目前对于引起胰腺β细胞功能紊乱的分子机制层面信息还知之甚少。
磷酸化是调节胰岛素分泌的一个重要参与因子，尽管近年来随着多组学技术的发展和普及，利用基因组、转录组或者基于高分辨质谱的蛋白质组学来研究2型糖尿病的案例已层出不穷，但是磷酸化修饰在因胰腺β细胞功能紊乱而伴随的关键信号通路转变中的机制尚不清楚。因此，从磷酸化修饰组学的角度揭示调控胰岛素分泌的分子机制具有十分重要的研究价值。
2019年6月4日，来自德国马普生物化学研究所的Matthias Mann团队在国际著名期刊Cell Metabolism上发表文章，利用磷酸化修饰组学探寻影响胰岛素分泌的分子信号通路，为之后2型糖尿病的药物靶点研发和治疗提供了坚实的科学依据。作者采用Label-free的技术对正常小鼠和肥胖糖尿病小鼠的胰岛组织进行了蛋白质组和磷酸化修饰组学的分析，一共鉴定到6500个蛋白以及13000个磷酸化肽段。研究发现GSK3-PDX1轴是控制胰岛素分泌的关键信号节点，抑制GSK3能恢复胰腺β细胞面对高糖处理时正常分泌胰岛素的能力。
1、糖尿病小鼠胰岛组织内蛋白和磷酸化整体水平发生显著变化
作者分别从13周的正常和肥胖糖尿病小鼠体内采集了胰岛组织（样本策略），采用Label-free蛋白质组学定量进行了蛋白和磷酸化修饰组学鉴定（Figure 1a）。研究共成功定量到6500个蛋白和发生在3821个蛋白上的超过14000个磷酸化位点。PCA分析显示，根据蛋白和磷酸化组学结果能够将正常和糖尿病状态的胰岛成功分为俩个群体（Figure 1b&c）。胰岛素分泌的紊乱，mTOR激活和AMPK的抑制都已经被报道为2型糖尿病胰岛的特点，作者的结果与此吻合（Figure 1d&f）。
Figure 1 糖尿病和正常小鼠的胰岛蛋白质组和磷酸化修饰组分析
二、糖尿病小鼠胰岛中关键信号通路发生重构
研究者对患病小鼠胰岛中显著变化的激酶底物motif进行了分析（Figure 2a） 。与高营养素诱导mTOR激活一致， p70S6K底物motif显著富集。除此之外，一些已知的对调节胰岛素分泌起到关键作用的激酶如PKA 和PKC的底物磷酸化水平显著降低（Figure 2b）。
Figure 2患病小鼠胰岛中显著变化的激酶底物motif分析
为了进一步了解再胰岛细胞功能缺陷的情况下信号通路如何重构，研究者基于磷酸化结果对关键通路进行了绘制（Figure 3）。糖尿病胰岛中，mTOR通路的激活通过p70S6K负反馈调节抑制了AKT活性。GSK-3β是AKT的重要底物，其活性受AKT的负调节。结果显示，在db/db胰岛中，GSK-3β的GSK-3β 的Tyr216磷酸化水平显著上调，GSK-3β在糖尿病胰岛中活性增加。已有文章证实，PDX1 的是GSK3 β 和HIPK2直接作用底物，PDX1的Ser269磷酸化可引起该蛋白进行蛋白酶体降解。在本研究结果中，PDX1的Ser269的磷酸化水平上升，其蛋白水平下降，而其mRNA水平不受影响。因此，作者推测糖尿病胰岛中信号传导轴从mTOR通路激活开始，通过mTOR激活GSK3β以及导致PDX1降解。
三、db/db胰岛中PDX1抑制使得下游GLUT2表达量下调并且抑制β细胞糖酵解
基于鉴定到的GSK3β激活以及PDX1降解过程，作者推测PDX1在胰岛细胞的生理层面发挥着重要的作用。那么PDX1下游靶蛋白的表达是否同样受到影响？结果显示，与健康组织相比，db/db胰岛中所有PDX1的下游蛋白都发生显著下调，其中GLUT2蛋白下调64倍（Figure 4a）。GLUT2是一种葡萄糖感受器，能够有效调节血糖浓度，密切参与葡萄糖诱导的胰岛素分泌。此外，大部分参与糖酵解和TCA循环途径的关键酶都在糖尿病小鼠胰岛中显著下调，从而整体影响了葡萄糖代谢过程（Figure 4b）。
Figure 4 PDX1下游靶蛋白GLUT2表达量下调并且抑制β细胞糖酵解
四、糖毒性诱发依赖于GSK的PDX1下调
为了进一步研究糖毒性是否可独立触发β细胞中GSK-3β激活，继而引起PDX1及其下游靶蛋白的降解。作者对三个不同志愿者胰岛和INS1e大鼠β细胞分别给予高葡萄糖处理，随后对其进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析，得到的结果与之前的组学数据呈现一致。那么能否通过抑制GSK3来改善糖尿病情况呢？作者使用GSK3抑制剂LY2090314处理肥胖小鼠，发现不仅恢复GLUT2和PDX1的表达，同时完全恢复胰岛分泌胰岛素能力（Figure 5）。
综上所述，本文利用基于质谱的高通量蛋白质组学和磷酸化修饰组学对2型糖尿病的致病机制进行了进一步揭示。不仅发现在糖尿病小鼠胰岛中的大量关键信号通路重构，并且证明GSK3- PDX1轴是胰岛素分泌的关键调节环节，抑制GSK3能恢复胰腺β细胞面对高糖处理时正常分泌胰岛素的能力。这为之后有效的治疗2型糖尿病提供了更坚实的科学实验依据。
参考文献
Francesca Sacco, et al., 2019, Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets, Cell Metabolism.
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