在真核生物中，核小体是构成染色质的基本单元，其中的组蛋白为DNA的缠绕提供支持结构。组蛋白的翻译后修饰可以影响组蛋白之间、组蛋白与DNA、甚至不同核小体之间的相互作用，进而对基因的开放程度和转录，以及DNA的复制、损伤后修复等等过程进行调节。其中赖氨酸（K或Lys）位点存在多种化学修饰，例如乙酰化（Kac）和泛素化（Kub）。受益于质谱技术的发展，近年来有更多的新型赖氨酸酰化修饰被报道，包括巴豆酰化（Kcr），2-羟基异丁酰化（Khib），β-羟基丁酰化（Kbhb）等。在新发现的修饰中，赖氨酸丙二酰化（Kmal）、琥珀酰化（Ksucc，也叫丁二酰化）和戊二酰化（Kglu）在结构中均含有末端羧基，在正常生理条件下，能将赖氨酸氨基携带的正电荷转变为负电荷，有可能显著改变蛋白底物的结构和功能。但相关研究尚处于起步阶段，学界对于此类修饰的生物学意义理解亦不深入。图1. 开发戊二酰化化学报告基团检测赖氨酸戊二酰化（上）。赖氨酸戊二酰化存在于多个组蛋白位点（下）。赖氨酸戊二酰化修饰（Kglu，图1）最早发现于线粒体蛋白并参与调节细胞代谢【1】。最近的研究还显示，Kglu还与人类精子的运动能力相关【2】。组蛋白H2A上也发现有3个Kglu修饰位点【1】，但其功能未知；目前对组蛋白上Kglu的修饰亦缺乏系统性的研究。2019年9月18日，香港大学化学系李祥课题组联合生物系阮永怡课题组及医学院黄永瀚课题组（李祥课题组博士后鲍秀丛为第一作者）在Molecular Cell杂志上发表了题为Glutarylation of Histone H4 Lysine 91 Regulates Chromatin Dynamics的文章，首次系统性的鉴定了人类组蛋白上存在的27个Kglu位点，并对进化上非常保守的H4K91位点Kglu修饰的功能进行了深入研究。为了系统性的鉴定Kglu修饰的蛋白谱，研究人员应用化学生物学方法，首先设计并合成了戊二酰化特异性的化学报告基团（chemical reporter），GluAM-yne（图1）。该分子在戊二酸的第三位碳原子上加装了末端炔烃，并对两个羧基进行了乙酰羟甲基酯化；在GluAM-yne被细胞摄入并对蛋白Kglu修饰之后，应用CuAAC 点击反应（copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition(CuAAC) “click” reaction）即可对被修饰的蛋白进行Tag标记，从而可以分析Kglu修饰蛋白组。应用该方法，研究人员发现，此化学探针成功的标记并富集了已知的Kglu修饰的线粒体底物，GAPDH和CPS1, 此外还发现Kglu修饰主要发生在细胞核内，并且H2A/H2B/H3/H4组蛋白上均存在大量的Kglu修饰。在对人组蛋白进行了液相色谱串联质谱分析（Liquid chromatography–mass spectrometry）后，研究人员在人组蛋白上检测并鉴定出27个Kglu位点（图1）。其中组蛋白H4球状结构域K91位点的Kglu修饰引起了研究人员的关注。该位点赖氨酸位于核小体内组蛋白H3/H4四聚体与H2A/H2B二聚体之间的界面，并与H2B上的谷氨酸残基形成盐桥以稳定核小体。当H4K91位点赖氨酸被戊二酰化修饰之后，原本带有正电荷的赖氨酸变成了携带负电荷，因此很可能影响核小体的稳定性。为研究Kglu修饰对于核小体结构的影响，研究人员需要制备高纯度并且带特定位点Kglu修饰的组蛋白。为解决上述问题，李祥课题组利用表达蛋白连接技术的化学合成手段（expressed protein ligation, EPL），成功合成了具有Kglu修饰的H4K91组蛋白。通过凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA），研究人员发现Kglu修饰阻碍组装组蛋白八聚体的形成及其稳定性。进一步的荧光共振能量转移方法（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）定量研究该位点的Kglu修饰对核小体结构的稳定性的影响程度，揭示了Kglu修饰通过影响组蛋白间的相互作用从而影响核小体的稳定性。为了更系统的探究H4K91glu的分布及功能，研究人员构建了H4K91glu特异性的多克隆抗体，并且发现该修饰在进化上高度保守。由于哺乳动物细胞中组蛋白基因有很多拷贝数，研究人员选择了出芽酵母进行了H4K91E（赖氨酸变为谷氨酸，谷氨酸携带两个羧基，可以模拟戊二酰化修饰）点突变。研究发现H4K91E突变使得染色质的结构发生改变，从而导致端粒区域的基因转录水平上升，同时酵母细胞的染色质聚集程度也相比野生型降低, 也使得酵母细胞的细胞周期受阻，并增强了其对DNA损伤高度敏感性。此外，RNA-seq测序分析也显示，H4K91E突变使得数百种原本低丰度表达的基因的转录水平显著上调。这些结果进一步佐证了H4K91glu修饰对核小体结构的疏松作用，并对基因转录、DNA损伤后修复和细胞周期具有重要的调控作用。那么，什么分子对组蛋白上的Kglu修饰进行调节呢？早期的研究显示，大量定位于线粒体中的去酰化酶Sirt5具有去除Kglu修饰的作用【1】。李祥课题组的研究人员发现，干扰Sirt5并不影响组蛋白上Kglu修饰水平，而定位于细胞核内的Sirt7才是组蛋白Kglu的关键去修饰酶。体外实验显示，重组表达的人源Sirt7可以高效的将Kglu修饰从H4K91glu多肽以及合成组蛋白上去除。有意思的是，Sirt7的去戊二酰化作用依赖NAD和DNA的同时存在。细胞内实验表明干扰Sirt7表达显著上调H4K91glu水平，而过表达Sirt7显著下调H4K91glu修饰。在细胞进行有丝分裂或者遭遇DNA损伤时，核小体会快速组装使得染色体浓缩；研究人员发现，此过程也依赖Sirt7介导的H4K91glu去修饰作用。此外，李祥课题组还发现，已知的组蛋白乙酰转移酶KAT2A通过与α-酮己二酸脱氢酶复合物（α-KADH，介导α-酮己二酸向戊二酰辅酶A的转化）中的DHTKD1蛋白直接结合，介导组蛋白赖氨酸的戊二酰化修饰，并揭示KAT2A的乙酰/琥珀酰/戊二酰转移酶功能的实现分别依赖于与其相结合的复合物结构, SAGA，α-KGDH[3]，α-KADH。对人源细胞进行染色质免疫共沉淀后测序分析（ChIP-seq）显示，与KAT2A基因组分布相一致，H4K91glu主要在转录起始位点附近区域富集，并且在高丰度表达的基因中富集程度更高。这再次验证了H4K91glu疏松核小体结构，促进基因开放程度的功能（图2）。
图2. 组蛋白戊二酰化由Sirt7和KAT2A-aKADH复合物共同调控。该修饰通过改变核小体动态结构参与基因转录的调控。
这些研究首次全面的鉴定出了Kglu在人组蛋白中的27个分布位点，系统的分析了进化上保守的H4K91glu修饰对核小体组装、基因表达、DNA损伤后修复、细胞周期等染色质相关功能的重要调控作用，从基因组学水平分析了H4K91glu分布图谱，并鉴定出了组蛋白戊二酰基转移酶（KAT2A）和去戊二酰化酶（Sirt7）。1. Tan, M., et al., Lysine glutarylation is a protein posttranslational modificationregulated by SIRT5. Cell Metab, 2014. 19(4):p. 605-17.2. Cheng, Y.M., et al., Lysine glutarylation in human sperm isassociated with progressive motility. Hum Reprod, 2019. 34(7): p. 1186-1194.3. Wang, Y., et al., KAT2A coupled with the alpha-KGDH complexacts as a histone H3 succinyltransferase. Nature, 2017. 552(7684): p. 273-277.原文链接：https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(19)30657-4.pdf本文经授权转载自BioArt微信公众号，景杰学术团队报道，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿、等其他合作需求，请添加微信ptm-market咨询。