与“癌”共舞，Cell Reports：蛋白质组学助力解决KRAS靶向疗法耐药性困局

本文由景杰学术团队报道

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针对肺癌驱动基因之一的KRAS基因突变研究，一直以来是学术界关注热点之一。KRAS是人类癌症（例如胰腺癌、结直肠癌和肺癌）中最常见的突变，大约占突变总比例的30%左右，在具有“癌症之王”之称的胰腺癌里，这一数字甚至高达90%。鉴于KRAS在肿瘤中的关键作用和普遍性，特异性地抑制KRAS有巨大的医学前景。

由于在结构上缺乏让小分子或药物结合的靶点，KRAS因此一度被行业认为“不可成药”。幸运的是，经过了几十年持续不断的研究，KRAS^G12C癌蛋白的共价抑制剂近些年已经被陆续开发出来，并在临床试验进行了评估，让KRAS突变不再“无药可治”【1】。但众所周知，靶向疗法的耐药性很常见，可能会限制住KRAS抑制剂（KRASi）的长期疗效，全面表征KRASi的抗性机制之重要性不言而喻。

近日，美国达纳·法伯（Dana-Farber）癌症研究中心的Joseph Mancias教授团队在国际知名期刊Cell Reports发文，研究人员运用TMT定量蛋白质组学，对目前正在接受临床试验评估的新开发KRAS^G12C抑制剂的耐药机制展开了深入研究。研究比较了不同肿瘤细胞系（胰腺癌，肺癌）、不同细胞培养条件（2D,3D）以及不同的KARS抑制剂（ARS-1620, compound 4）所造成的蛋白质组差异，全面表征了KRAS^G12C突变肿瘤细胞对KARSi的适应性机制。

本研究共定量到10805种蛋白质，这也是迄今为止最全面的KRASi蛋白质组学库。基于蛋白质组学数据，作者确定了KRASi与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），HSP90，CDK4 / 6和SHP2抑制剂的有效组合，在某些情况下，将对KRASi单一疗法的细胞抑制反应转化为对联合治疗的细胞毒性反应，为体内的临床前试验奠定了基础。

Graphical Abstract

研究人员选择了两种目前正在接受临床试验评估的新开发KRAS^G12C抑制剂：ARS-1620和compound 4。研究发现这两种抑制剂能够显著抑制KRAS^G12C突变PDAC（胰腺导管腺癌）和NSCLC（非小细胞肺癌）两种癌细胞系的生长，IC50剂量处理的细胞在7天后恢复增殖能力证明产生了耐药性。

为了研究细胞对KRASi如何响应以及产生耐药性，作者使用了基于TMT标记的定量质谱（质谱策略），比较了在PDAC和NSCLC细胞中加入抑制剂后不同时间点引起的蛋白组变化（样本策略）。通过数据分析，进一步选取了24小时和7天的蛋白质组来研究短期和长期 KRASi处理引起的细胞内通路改变。

图1、定量蛋白质组学方法确定PDA、NSCLC对KRASi的适应机制

蛋白质组学分析发现，来自不同类型的肿瘤细胞系（肺癌，胰腺癌）在KRASi处理后蛋白质组显示相似的途径富集。对前300种上调的蛋白（24小时和7天）的PPI和GO分析表明，两种肿瘤细胞系中上调的通路存在相似性。在24h时间点，细胞系之间重叠功能的分析包括: 代谢（PPP和脂质代谢）、细胞因子信号传导和PI3K / AKT信号传导途径的激活；而在7day时间点，长期适应与改变有关的主要是：抗原呈递、对氧化应激的反应和溶酶体途径。

图2、肿瘤细胞系（肺癌，胰腺癌）KRASi蛋白质组的生信分析

使用二维细胞培养（2D）来模拟对治疗的适应性反应可能是一种经典的方法，但在某些情况下，三维（3D）模型可以更好地概括体内生理和药物敏感性。因此研究人员选择了两种NSCLC细胞系（HCC44和H2030），进一步测试了2D与3D模型中药物反应的差异。研究发现与2D条件相比，在3D中对KRASi的敏感性至少提高了20倍。对用KRASi处理72小时（2D，10 mM；3D，0.5 mM）的HCC44细胞进行了蛋白质组学分析，结果显示3D与2D条件下，与DNA复制/转录/修复和TCA周期相关的蛋白质均发生下调，MAPK / mTOR途径和抗原呈递均上调。与2D相比，3D生长条件与抗原呈递、先天免疫应答、信号传导途径、碳水化合物代谢和ECM的上调相关。

图3、在2D和3D生长条件下对KRASi适应的机制

研究同时发现，肿瘤细胞对KRASi的急性和长期适应机制不同。急性适应机制中，细胞周期途径、转录和翻译发生下调，脂质代谢、TCA循环等则会发生上调。而长期KRASi治疗使得细胞周期途径、转录、DNA修复、线粒体呼吸及溶酶体代谢发生上调，而mTOR信号发生明显减少。这也为解决KRAS靶向疗法耐性药性提供了理论依据。

图4. KRASi急性和长期适应机制不同

最后，研究人员基于蛋白质组学数据，结合细胞实验，进一步筛选和确定了几种候选的KRASi联合疗法以抑制耐药性产生。其中，KRASi与HSP90抑制剂 (17-AAG)和细胞周期抑制剂(CDK4/6i)的联合使用有效地阻断了2D和3D细胞培养模型的生长，为体内的临床前试验奠定了基础。

综上所述，研究人员运用TMT定量蛋白质组学等技术，对目前正在接受临床试验评估的新开发KRAS^G12C抑制剂的耐药机制展开了深入研究。研究提供了迄今为止最全面的KRASi蛋白质组学库，全面表征了对KRASi的适应性，并确定了具有潜在治疗作用的组合方案，为KRAS^G12C抑制剂的耐药性和临床应用奠定了基础，也进一步表明了蛋白质组学技术在精准医学中的重要研究价值。

参考文献

1. Zeng, et al., 2020.Exploring Targeted Degradation Strategy for Oncogenic KRAS^G12C. Cell Chemical Biology.

2.Santana-Codina et al., 2020. Defining and Targeting Adaptations to Oncogenic KRAS^G12C Inhibition Using Quantitative Temporal Proteomics.  Cell Reports.

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免疫治疗：Cell | 蛋白质组学揭示黑色素瘤响应免疫治疗的线粒体依赖性软黑色素瘤耐药性：Clinical Cancer Research：脑脊液蛋白质组学揭示软脑膜黑色素瘤转移及治疗耐药性的分子特征
化疗药物耐药：Cancer Research| 高通量蛋白质组和磷酸化组分析揭示化疗药物耐药性和糖酵解过程的联系

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