佳文分享 | 影响胚胎着床的胚胎因素

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作者：周 怡，李婷婷，方 丛

单位：中山大学附属第六医院生殖医学研究中心，广东 广州

本文来源：实用妇产科杂志 2019 年 2 月第 35 卷第 2 期

胚胎着床是胚胎经过定位、黏附和侵入种植于子宫内膜的过程，在人体外受精/卵胞浆内单精子注射—胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET)周期中胚胎着床率约 30%，反复着床失败(recurrent implantation failure，ＲIF)的发生率为12%～34%。胚胎因素、子宫因素、母体免疫异常等原因均可导致胚胎着床失败。胚胎着床成功在临床实践中定义为出现超声下可见妊娠囊。目前ＲIF尚无统一定义，最近一篇系统回顾根据已有研究和专家意见建议定义为:连续两次优质胚胎移植，累计不少于4枚第3天胚胎和2枚囊胚，仍未获得妊娠［1］。胚胎质量和发育潜能是影响胚胎着床的决定性因素，胚胎染色体异常、透明带硬化、体外培养环境不当均会导致胚胎着床失败。本文将全面阐述影响胚胎着床的胚胎因素及研究进展，为从胚胎方面提高着床率提供新思路。

1 染色体异常

染色体异常是损害胚胎的发育能力、导致着床失败的主要原因，自发性流产中胚胎非整倍体率高达70%［2］。配子异常和胚胎卵裂异常均可导致染色体异常。Kort等［3］回顾性分析了既往不良妊娠史( 包括复发性流产、非整倍体妊娠、IVF 失败) 和非医学原因行性别鉴定IVF患者的植入前遗传学筛查( preimplan- tation genetic screening，PGS) 结果，非整倍体数在有不良妊娠史患者中高，且非年龄依赖。

女性＞35岁后怀孕几率和胚胎着床率明显下降， 其主要原因是非整倍体卵子增加，胚胎染色体异常发生率高。Harton 等［2］的一项多中心回顾性分析中，不同年龄组 IVF / ICSI-ET 周期行微阵列比较基因组杂交( comparative genomic hybridization，CGH) ，筛选出整倍体胚胎移植。结果非整倍体率与年龄呈正相关，＜ 35岁发生率为 53. 1%，≥43 岁为 92. 6%。胚胎着床率在＜42 岁的患者中没有随年龄改变，≥43 岁的患者则下降。移植整倍体胚胎提高了高龄患者的着床率，这提示胚胎染色体非整倍体性是导致高龄女性着床失败的重要原因。

染色体嵌合体是指在一个个体中同时存在两种及以上染色体核型的细胞体系，在胚胎发育中很常 见，着床前胚胎发生率为 15% ～ 90%［4］。嵌合体会影响胚胎的发育和着床能力，影响程度与染色体异常发生的时间、数量、位置和后续发育等因素相关。在小鼠的嵌合体胚胎模型中发现嵌合体存在会导致不良结局，但随着胚胎的发育，非整倍体细胞比例会减少，且有足够数量正常细胞的嵌合体胚胎能发育为健康胚胎。这说明胚胎在发育过程中有一定的自我选择和修复能力，嵌合体存在不一定会影响胚胎的最终结局，还需考虑嵌合体数量、发生的位置等。Spinella等［5］在一项前瞻性研究中为 77 例患者移植了嵌合体囊胚，根据嵌合体中非整倍体比例分为低比例嵌合体 (＜50%) 和高比例嵌合体( ＞ 50%) 。研究结果示低比例嵌合体较高比例嵌合体的胚胎种植率、临床妊娠率 和活产率高( 分别为 48. 9% vs 24. 2%，40. 9% vs15. 2%，42. 2%  vs  15. 2%) 。与移植整倍体囊胚患者比较，高比例嵌合体患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率均降低( 分别为 24. 4%  vs 54. 6%，15. 2%  vs46. 4%，15. 2%  vs 46. 6%) ，低嵌合体患者则无差异。

2 透明带因素

透明带在阻止多精受精和维持胚胎完整性方面起重要作用，其异常会影响胚胎的发育，导致着床失败。暗色透明带( dark zona pellucida，DZP )  指在光镜下折光率低、透光性差、颜色暗，DZP会导致优质胚胎形成率、着床和临床妊娠率下降。既往认为透明带厚度( zona  pellucida  thickness，ZPT)  及透明带厚度变化 ( zona  pellucida  thickness  variation，ZPTV) 会影响胚胎着床率，但 Lewis 等［6］对 768 例第 3 天新鲜移植胚胎的ZPTV 与胚胎着床之间的关系进行分析，发现 ZPTV 与胚胎着床之间无统计学关联。胚胎孵出是着床过程中的重要环节，如透明带硬化则不能孵出，导致着床失败。辅助孵化( assisited  hatching，AH) 包括机械法( 部分透明带切除) 、化学法、激光法，近年来激光法被广泛应用于临床，关于 AH 的作用一直存在争议。有研究指出AH可以提高ＲIF患者的着床率和临床妊娠率［7］。但在年龄＜38 岁且 ZPT≥13  μm 妇女中，AH 不能提高胚胎着床率、临床妊娠率及活产率［8］。最近的一项系统回顾认为［9］，透明带打薄 AH 对新鲜胚胎移植周期改善临床结局作用有限，透明带打孔 AH 可以提高冻融胚胎移植周期的着床率和临床妊娠率。

3 胚胎培养

良好的培养环境与技术是保证胚胎正常发育的基础，培养环境会直接影响早期胚胎的质量，进而影响胚胎的着床。培养液是与胚胎直接接触的环境，也是胚胎体外发育唯一的营养来源，其组分、配比、pH值、渗透压均与胚胎的质量密切相关。现商品化的培养液主要包括序贯培养液和单一培养液。单一培养液有利于囊胚形成，提高囊胚质量，但是对临床结局两者无差异［10］。有学者认为胚胎在发育过程中可产生一些促进发育的因子，将胚胎成组培养可以提高囊胚形成率和着床率。Ebner等［11］将 72 例患者 936 原核期胚胎随机分为 3 组，分别为单独培养、同一微滴单独培养和成组培养( 每微滴 3 ～ 5 个) ，均培养至囊胚期。结果成组培养的胚胎有更高的囊胚形成率(  3  组分别为40. 8%、45. 2% 和 55. 8%) ，临床妊娠率也提高。也有将卵裂期胚胎成组培养至第 3 天，与单独培养胚胎相比着床率与妊娠率无差别，但在＜ 35 岁妇女中增加可用囊胚数［12］。目前各研究中所使用的培养方案不统一，尚需更多重复试验证实其作用。

在传统的培养体系中，评估胚胎发育情况需将胚胎从培养箱中取出。多次、长时间的观察会引起培养液温度、pH值等参数改变，进而对胚胎发育产生不良影响。Time-lapse实时观察系统无需移动胚胎就可进行观察评估，避免了对培养环境的干扰，可提高胚胎质量和着床率。Barrie等［13］ 根据患者年龄、获卵数、治疗方案和取卵时间将使用Time-lapse 培养箱和标准培养箱的患者配对，通过分析比较得到两组临床妊娠率、着床率差异有统计学意义 ( 分别为 44. 8% vs 36. 5%，39. 3%  vs 32. 2%) 。但近期的其他研究发现［14］，Time-lapse 培养体系没有提高 IVF / ICSI 新鲜周期着床率。该研究未追踪在试验中冷冻的胚胎结局，是否能获得累计妊娠结局的提高还需进一步探讨。

4 胚胎评估

筛选出最具发育潜能的胚胎移植是提高 IVF / IC- SI-ET 成功率的关键，传统的胚胎形态学评估仍是目前最常用、最经典的方法。胚胎的形态学特点能反映胚胎质量，可以较好预测胚胎发育潜能。卵裂期评估低质量的胚胎发育为囊胚几率降低，其发育而成的囊胚着床率也下降40%［15］。囊胚期胚胎评分可以反映其着床和继续妊娠能力。Irani等［16］ 回顾性分析了417 例冻融整倍体囊胚移植周期，根据冷冻前评分将胚胎分为质量极优、优质、标准和差 4 组，发现极优组和优质组的妊娠率显著高于差组( 分别为 84. 2%、61. 8%和 35. 8%) ，内细胞团( inner  cell  mass，ICM) 评分为 A的胚胎妊娠率高于 B 和 C ( 分别为 76. 2%、53. 6% 和13. 5%) 。滋养层细胞( trophectoderm，TE) 评分对预测胚胎发育潜能更重要。TE 评分为 A、B、C 时着床率分别为 67%、51%和 25%，活产率为 57%、40% 和 25%，三者之间差异有统计学意义，且ICM / TE 评分中 BA 着床率优于AB 和BB( 分别为 80%和 52%、44%)［17］。

形态学评分不可避免带有胚胎学家主观因素，且没有一个是胚胎质量的绝对标志，在评分为优质的胚胎中非整倍体并不少见。Time-lapse实时观察系统可以动态连续观察胚胎的发育情况，观察到胚胎不正常分裂、碎片出现时间、囊胚形成时间等在传统评估体系中无法获得的信息，从而提供更多客观准确的形态动力学参数，利于全面评估胚胎的发育潜能，筛选出最优的胚胎，提高着床率。目前其对胚胎的评估价值和临床结局的改善仍有争议。寻找能够客观预测胚胎发育潜能的非侵入性指标对筛选优质胚胎，提高着床率和临床结局非常重要。

5 胚胎移植选择策略

胚胎移植是 IVF / ICSI-ET 过程中的最后一步，也是影响胚胎着床的关键因素。胚胎移植的时期、数目、移植技术、新鲜或者冻胚移植都会关系到着床成功率。在早期受体外培养技术的限制，多选择 D2 / D3 胚胎移植。随着培养技术的不断优化，越来越多人选择延长培养至 D5 / D6 囊胚移植。囊胚移植更符合人的生理状态，且延长培养能够淘汰发育差的胚胎，提高胚胎着床率。相关研究证实囊胚移植可以提高患者的着床率和妊娠率，但近期 Levi-Setti 等［18］ 在＜ 39 岁、至少获 3 个受精卵和既往少于 4 次 IVF / ICSI-ET 周期史的患者中发现，新鲜周期中囊胚和卵裂期移植着床率和妊娠率无差异。囊胚移植会导致可移植和冷冻胚胎数减少，对于累计活产率的影响还需进一步研究。

胚胎冷冻保存技术取得突破，使每取卵周期的成功率和胚胎利用率极大提高。在 ＲIF 患者中整倍体冻胚移植比鲜胚移植成功率高。移植数目增加能提高着床率，但多胎妊娠率增加了高危妊娠发生和孕产妇死亡的概率。我国已规定每个移植周期移植胚胎数不超过 3 个，35 岁以下妇女第 1 次助孕移植胚胎数不超过 2 个。

6 其他因素

线粒体是为细胞代谢提供能量的重要场所，当胚胎发育异常时其能量代谢会发生改变，线粒体 DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA ) 拷贝数会代偿性增加。高龄女性、非整倍体和妊娠失败的胚胎中有较多的mtDNA 拷贝数，且整倍体胚胎 mtDNA 拷贝数超过一定水平时不能着床［19］。mtDNA 拷贝数与胚胎质量和种植潜能相关，测量 mtDNA 拷贝数可作为评估胚胎发育潜能的指标。Victor 等［20］则在研究中指出，mtDNA拷贝数与胚胎整倍体性、年龄、着床能力不相关，其对胚胎发育潜能的预测价值有待商榷。

此外，胚胎在培养过程中产生的一些物质与发育潜能和着床力相关，培养液中检测胚胎基质金属蛋白酶( MMP-9) 、白细胞介素 8( IL-8) 可用于预测着床率和妊娠率。紧缩现象指在囊胚形成期间，卵周间隙因滋养层细胞退缩再次出现。有研究发现［21］，紧缩现象的发生在非整倍体胚胎中高于整倍体，且会损害整倍体胚胎的着床能力。

7 结 语

辅助生殖技术的不断进步帮助众多不孕不育夫妇实现了为人父母的愿望，但胚胎着床失败仍是解决不孕症的难题。现胚胎体外培养技术日趋完善，冷冻技术提高了胚胎利用率，筛选出最具发育潜能的胚胎移植是提高着床率的关键。植入前遗传学检测能够筛选出染色体异常，Time-lapse实时监测系统能够提供胚胎发育过程中客观的形态动力学指标。如将两者结合起来用于胚胎筛选，既能知道染色体是否正常，又能从形态学上更加客观全面评估，利于筛选出最具发育潜能的胚胎，提高着床率。因价格昂贵和缺乏足够证据，目前没有广泛使用，其应用是否利于妊娠结局还存在众多争议，需要进一步探讨。除此之外，多种动力学、代谢参数也被提出用于评价胚胎质量，其预测价值仍尚需更多研究明确。提高胚胎质量和寻找客观无创的胚胎发育潜能预测指标，是提高胚胎着床率仍需不断探索的问题。

参 考 文 献：

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