外泌体与囊胚发育及种植关系研究新进展

作者：徐天星，徐望明，张婕等

单位：武汉大学人民医院生殖医学中心

来源：生殖医学杂志

自40年前第1位试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术（ART）得到迅速发展，为无数受不孕不育症困扰的家庭提供了治疗措施。ART的最终目的是使临床妊娠率最大化。胚胎植入前遗传学检测（PGT）的出现及其技术逐步的完善从源头剔除了染色体或基因异常的胚胎，但临床妊娠率并没有显著的提升。因此，更多能预测胚胎发育潜能的检测技术出现了，如代谢组学、延迟成像技术等。通过对培养基包含的胚胎外泌体检测可以一定程度上反应胚胎的发育潜能、自身状态以及侵入子宫内膜的能力。因此，本文对外泌体与囊胚发育及种植的相关研究进行综述。

一、外泌体概述

1.外泌体的定义及产生：外泌体、微囊泡同属于胞外囊泡。胞外囊泡是所有体内或是离体细胞在受到一定刺激或是处在相对稳定环境中释放出的一种双层膜囊泡状结构小体。胞外囊泡主要根据囊泡的直径大小以及产生途径进行分类。微囊泡，也被称为包含腔内囊泡的多囊泡内体，是质膜出芽所形成，直径范围从50-500nm甚至更大。多囊泡内体在成熟过程中膜会内陷萌芽形成腔内囊泡，最终与质膜相融合，其释放出的囊泡称之为外泌体，其直径通常介于30-150nm之间。这种膜融合效应是在钙离子的介导下完成的。

2.外泌体的组成及功能：外泌体作为一种细胞产生的分泌囊泡，其内含物根据分泌细胞的来源不同有较大的区别。总体上说，外泌体中的物质主要包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物以及酶等。外泌体中的脂质，如神经酰胺、胆固醇和鞘脂等，构成的脂质筏被证明在免疫信号传递中有较大作用。核酸，主要是微小RNA(miRNA）及mRNA，也称作“外泌体穿梭RNA”，被认为是遗传物质的载体，能够调控受体细胞特定的生物学功能。酶则主要包含基质金属蛋白酶（MMP）、金属蛋白酶（ADAM），其对于癌症疾病中组织破坏、肿瘤的浸润转移，以及生殖过程中胚胎植入子宫内膜的微环境构造都有显著影响。

外泌体中的蛋白质包括脂质蛋白，膜蛋白；糖如聚乳糖胺，支链唾液酸，高甘露糖N-聚糖。早期外泌体被认为是细胞向外运输代谢废物的一种途径，而近年来发现它能够在细胞间传递物质进行信息交流。目前国内外对于外泌体的功能研究，主要聚焦在肿瘤以及免疫方面。如癌细胞分泌的外泌体可以通过诱导基质细胞分泌促癌生长因子来调节局部微环境，肿瘤患者体内提取的外泌体具有明显血管生成的作用，树突状细胞产生的外泌体可以激活受体树突状细胞的翻译后加工，促进其成熟转变为免疫原性抗原呈递细胞。

二、胚胎的发育以及种植过程

1.胚胎细胞的体外培育与移植：通常胚胎在体外培养到卵裂期或囊胚期，便可以移植入患者子宫。囊胚是不孕患者通过ART促排取卵后精卵在体外受精并培育到第5或6天得到的胚胎细胞，此时细胞有明显的分化，胚泡腔内包含内细胞团，外围包绕着滋养细胞。而在此之前的卵裂期胚胎仍处在细胞增殖分裂阶段。囊胚移植相较卵裂期胚胎有较大优势。Yin等通过数据分析表明，囊胚移植相较卵裂期胚胎移植来说，患者妊娠活产率更高且其花费的成本更低。在复发性流产的患者中，胚胎存在染色体异常的概率较大，通过胚胎移植前遗传学筛查（PGS）对胚胎细胞进行检测，可通过活检的方式在初期剔除染色体异常的胚胎，而选择取囊胚滋养层细胞进行活检比取卵裂球对胚胎造成的损伤更小。基于上述原因，目前ART更倾向于选择囊胚进行染色体检查及移植。

然而胚胎的囊胚化进程并非完全同步，部分囊胚出现在受精后的第6天，发育稍滞后于第５天囊胚化的胚胎。这种滞后现象的出现会对种植率以及临床妊娠结局产生显著影响。通过回顾性队列研究随访分析单一冷冻囊胚移植患者的妊娠结局，Ferreux等发现相比于第6天囊胚化的胚胎，移植第5天囊胚化的冻融胚胎活产率显著升高，且具有统计学意义。

2.种植窗时期的母胎交流：种植窗，即胚胎植入子宫内膜最佳的时期，主要涉及胚胎和母体子宫两方面，两者存在着紧密的相互沟通交流、相互作用。移植胚胎的发育状况、程度、是否有染色体的畸形，外层滋养细胞的黏附、侵袭、植入的能力以及母体子宫内膜的容受性等都会对种植和妊娠结局产生影响。Salker等发现在胚胎的着床期子宫内膜的蜕膜化即使胚胎不在子宫中仍可以进行。这可能提示了胚胎与子宫内膜之间除了直接接触的相互作用，还能通过分泌信号分子的形式进行各种复杂交流。胚胎在子宫内膜上的种植通常可以分为定位、黏附以及种植3个阶段。在这一系列连续复杂的生理过程中有难以计数的各种信号分子参与并介导两者的变化，其分子机制尚未完全研究透彻。但有研究证实，部分参与其中的生物信息分子包括各种细胞因子、基质降解酶、趋化因子和整合素等。

三、外泌体参与母胎及胚胎间交流

随着对外泌体研究的不断发展，外泌体参与胚胎与子宫内膜之间信息交流的观点得以证实。Vyas等通过电镜观察体外受精卵从受精到形成囊胚的整个过程，发现自始至终都有表面标记CD9阳性的囊泡从胚胎分泌穿过透明带到达外侧。

Saadeldin等在2014年首次证明胚胎在培养基中分泌胞外囊泡并进行了外泌体的分离鉴定，发现了其中包裹的细胞多能性基因的mRNA，如Oct4、Sox2、Klf4、 c-Myc和Nanog，由此提出携带干细胞信号分子的外泌体可以作为工具来改善共培养胚胎的发育状况。Giacomini等也通过实验证明了处于囊胚期的胚胎分泌外泌体含量明显高于分裂期胚胎。近年来，学者们对胚胎来源外泌体进行了大量研究，提出外泌体相关特性某种程度上可以反映出胚胎的优劣性，并且可以用作无创性评估胚胎质量的工具。部分学者通过纳米示踪技术的实验方式分析外泌体本身的理化性质得到胚胎来源外泌体的大小、浓度与胚胎质量成反比的结论。也有研究者更关注于囊泡中的内容物，Pallinger等对DNA染色后通过流式细胞术分析胚胎分泌的外泌体，发现质量越好的胚胎产生的外泌体包含的DNA越少，推测这可能与胚胎需要进行自我修复有关。除了反映自身质量外，胚胎所分泌的外泌体可以被母体子宫内膜基底细胞所吸收，调节子宫内膜的容受性，最终影响种植率。信息的交流必定是双方的，Greening等证实母体子宫内膜分泌的外泌体亦会被胚胎滋养细胞所摄取，通过黏着斑激酶（FAK）途径上调滋养细胞的侵袭黏附力，促进胚胎植入子宫内膜。Latifi等的相关研究也发现子宫内膜衍生的外泌体内容物中基质金属蛋白酶（MMP）的存在，证明其促进胚胎附着和植入的潜在作用。胚胎着床也被认为是一种免疫炎性反应，外泌体通过传递一些细胞因子如人孕激素诱导阻断因子参与其中，诱导母体白介素-10（IL-10）等炎性介质的增加，促进妊娠期间免疫炎性反应的发生。

Giacomini等的相关试验同样证明植入前胚胎来源的外泌体携带可调节局部子宫内膜免疫系统的分子，如非经典主要组织相容性复合物（MHC）Ｉ类分子、人白细胞抗原（HLA）-G、免疫调节分子黄体酮诱导的阻断因子和一些具有调节功能的miRNAs。另外，外泌体的沟通交流不仅发生在胚胎与母体子宫内膜之间，也发生在体外培养的多个胚胎之间。Wydooghe等发表的文章中提到胚胎共培养的生长发育情况相较于单独培养更好，并证明胚胎之间的信息交流通过分泌多种信号因子进行，包括蛋白质、脂类、糖类、神经递质、miRNA和其他分子。

四、外泌体内miRNA与胚胎发育

外泌体中包含着众多种类的miRNA，miRNA由大约22个核苷酸组成，可通过靶向mRNa进行切割或翻译抑制基因表达水平，从而影响其生物学效应。miRNA在各种体液中均有分泌，如血清、尿液、唾液等，其在体内的存在形式主要与蛋白质相关，也可被包裹于胞外囊泡中。由于胞外囊泡具有更强的稳定性以及体内富集作用，囊泡中miRNA的生理作用被学者广泛研究。国外学者发现胚胎培养液中的miRNA会根据受精率、染色体状况和妊娠结局出现差异表达，如miRnA-191在非整倍体胚胎的培养基中浓度较高，miR-191、miR-372和miR-645在IVF／ICSI失败的培养液中浓度较高。Lv等在小鼠胚胎的相关实验中发现，胚胎与外泌体共培养时，通过增加miRNA-2在细胞外囊泡的含量和增加miRNA-21植入后的表达，可以达成更高的胚泡形成率，降低怀孕小鼠胚胎的凋亡率，揭示了miRNA在胚胎发育中的关键作用。提示胚胎细胞来源外泌体中的miRNA不仅可以作为预测胚胎质量的指标，而且对胚胎的生长发育也有长足的影响。

然而这种预测方式也有所局限，首先是受到不同受精操作方式的影响，通过ICSI受精的胚胎由于受到了外界物理性创伤，内部的某些物质会外露到培养液体中造成miRNA的浓度升高；其次是由于单个胚胎分泌的外泌体会在20-50μl的培养液中稀释，需要更加灵敏的实验方法完成检测。PGT的出现让试管婴儿的进程向前迈进了一大步之后，外泌体miRNA的检测具有稳定、无创等优势，相信会在克服上述困难后拥有更广阔的应用前景。

五、总结与展望

胚胎体外培养时胚胎细胞的发育与植入能力的差别影响ART的临床结局，造成胚胎种植率以及临床妊娠率的差异。外泌体作为一种反映其来源细胞质量与活力的物质，向靶细胞传递其内容物，能够介导胚胎与子宫内膜的交流，亦会对该差异现象有所体现。因此可以推断，对于胚胎细胞在培养基中分泌的外泌体本身及其内容物质如miRNAs的研究，有望作为一种新的检测手段，用于预测胚胎的发育潜能及临床妊娠结局。外泌体中miRNA通过受体细胞靶基因表达调节细胞功能，最终影响妊娠结局。而胚胎囊胚化进程不统一显著影响妊娠结局的现象是否能够通过胚胎外泌体得到合理的解释则需要进一步的实验探究。

参考文献：略

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责任编辑：渣渣喵

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