详细解读CRISPR-Cas9剪刀手的命运危机
伴随着CRISPR-Cas9编辑技术在体外研究的进步，其体内实验也不甘示弱，众所周知的卢铀教授及其研究小组在体内实验就实现了历史性意义的突破。而在人类不断的探索下CRISPR-Cas9如今正在面临如下的挑战。
Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.由题目可知本文的焦点是CRISPR-Cas9 基因编辑技术在体内编辑引起了意想不到的突变。那么就跟踪文章的作者，详细聊一聊CRISPR-Cas9这把剪刀手的命运危机！
文章的背景资料
CRISPR-Cas9技术应用广泛，并且越来越多的参与到基因治疗上面而来。本篇文章的背景资料便由此方向打开，2016年的原班科研人马用CRISPR-Cas9技术纠正Pde6b基因的突变位点，成功的将失明的rd1小鼠的视力得到恢复，并且文章已发表在MOLECULAR THERAPY杂志上[1]。
但是他们没有松懈，依然关心着的一个问题就是sgRNA在非靶向所在区带来的二次突变，虽然也早已经有文章表明如何在非靶向区规避或者减少该技术所带来的突变问题[2]。
文章内容分析：总结为以下5个方向进行分析
（1）体内突变的发现
全基因组测序已经被用于检测插入或者缺失的小片段但是没有探索过单核苷酸突变，在这里团队运用的是全基因组测序在CRISPR-Cas9处理的小鼠体内去鉴别非靶向序列突变位点情况，然而出乎意料的是基因组测序出多个突变位点。分别提取成功恢复视力的F03和F05小鼠以及没有矫正的对照组的小鼠的DNA，进行全基因组分析，结果如下原图。
团队根据这些突变位点，又做出了以下更深一步的分析。
（2）突变位点的分类，具有那些特征以及突变的发生是偶然还是必然？
从这张表格中，团队给读者做出了详尽的解释，两只小鼠的突变在单核苷酸突变（SNVs）上有1397个相同位点；在基因的缺失和插入方面（indels）测序有117个相同位点；而且文章指出与自发性遗传突变相比（3 to 4 indels and 90 to 100SNVs[4,5]）明显高出很多；这表明两个小鼠的突变绝非随机发生或者是偶然的，那么必然发生的突变可能会带来什么影响呢？
（3）这些非靶向区的突变能够带来哪些危害？
还是上面这张表格，读者可以清楚的看到外显子区的单核苷酸突变（SNVs）和插入与缺失（indels）的突变数目，其中5 indels 和24 SNVs突变可以引发蛋白编码区的非同义突变。5 indels 和其中一个 SNVs被认定为是有害的。而且有一些蛋白编码基因区的序列涉及到了人类和鼠类的表型分析。在29个编码区突变中有7个是两只小鼠都有的变异型，并且选择了24种与crispr相关的变异体，而且所有这些序列都被Sanger的测序证实了，如下图：Sanger测序证实了WGS检测到的CRISPR诱导的突变。
（4）突变序列与设计的sgRNA的同源性验证
还是上面这张表格给出了团队进行电子计算机预测的最具影响效力的前50个序列，然而在两只成功恢复视力的小鼠中无一有突变，而且预测的这前50个序列与导向RNA和真实靠近脱靶的编码区和非编码区的突变的序列之间并没有绝对的同源性。这个结果表明目前的计算机预测技术还不能够牢靠的用于预测准确的脱靶区序列，不可过分依赖，如下图：导向RNA与实际离靶区域的序列比对显示出没有实质的同源性。
（5）面临的挑战以及期望解决问题的观点
根据这些出现的现象作者提出将来面临的挑战，虽然团队CRISPR-cas9治疗的小鼠目前没有显示明显的眼睛以外的其他表现，但是当它们被挑战或培育成纯合子时，可能会暴露其它的表型也只是时间的问题。虽然团队提出了这些问题，但是也拘泥于体内脱靶突变是不是sgRNA不够优化所带来的问题。最后作者提出该技术临床应用需谨慎，并且团队倡议研究人员可以运用WGS全基因组测序技术检测脱靶突变区。
如今，CRISPR-Cas9 这把基因编辑的剪刀手，通过对此次的危机处理，希望在体内的鉴定靶突变技术领域能得到新的突破，引起CRISPR-Cas9剪刀手又一次划时代的进步。
参考文献：
[1] Tsai SQ,Nguyen NT,Malagon-Lopez J,et al.CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat Methods 2017.
[2] Cameron P,Fuller CK,Donohoue PD,et al.Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.Nat Methods 2017;14:600-606.
1. Wu, W.H. et al. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model
of retinitis pigmentosa. Mol. Ther. 24, 1388–1394 (2016).
2. Koo, T., Lee, J. & Kim, J.S. Measuring and reducing off-target activities of
programmable nucleases including CRISPR–Cas9. Mol. Cells 38, 475–481 (2015).
4. Nachman, M.W. & Crowell, S.L. Estimate of the mutation rate per nucleotide in
humans. Genetics 156, 297–304 (2000).
5. Roach, J.C. et al. Analysis of genetic inheritance in a family quartet by whole-
genome sequencing. Science 328, 636–639 (2010).
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