上海CRISPR/Cas9 基因编辑技术学习班（9 月 23-24 日）

CRISPR/Cas9 基因编辑技术学习班（9 月 23-24 日）

CRISPR/Cas9技术培训背景介绍：

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。

目前，CRISPR/Cas9系统已经广泛用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。本学习班将详细讲解CRISPR/Cas9基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，将让大家详细了解到具体如何利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。

讲师介绍：李博士，德国慕尼黑工业大学海归博士，具有多年丰富的基因编辑实操经验

参与德意志研究基金委项目(DFG)用于人类癌症研究的转基因克隆猪模型 (SCHN971/3-1)

Ø博士导师为原英国Roslin Institute克隆羊“多莉”团队的Prof. Dr. Angelika Schnieke

Ø成功构建世界上第一头ROSA26双荧光猪模型，极具有生物医学价值(已发表)。随后，成功构建Kras点突变基因修饰克隆猪模型，该模型为构建胰腺癌大动物模型提供了有力工具，为胰腺癌相关靶向药物开发，寻找新的胰腺癌治疗手段等提供了新的动物模型。

Ø熟练掌握载体构建，基因打靶(如用传统targeting vector或TALENs, CRISPR/Cas9介导的基因Knock-out和Knock-in)， Cre/loxP系统，动物细胞分离和培养，细胞转染(Electroporation, Nucleofection, Nanofection, Stemfect RNA transfection)，DNA甲基化和RNA甲基化分析，焦磷酸测序，各种分子生物学实验(Southern blot, Western blot, qPCR, RT-PCR)等技术。有较强的分子生物学，细胞生物学，遗传学，生物信息学，发育生物学，动物生物技术等理论基础。

Ø博士期间共指导德国学生3人

日程安排

第一天 周六 上午 9:00-12:00

理论一：基因修饰技术简介

1，基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍

2，CRISPR/Cas9 结构和特点

3，如何使用 CRISPR/Cas9 系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤）

4，新基因编辑工具 Cpf1 的结构、特点、工作原理（基因编辑工具知识拓展）

5，如何使用 Cpf1 系统对特定基因进行敲除或定点插入

6，Cpf1 与 CRISPR/Cas9 的异同

7，Cpf1 的应用和技术展望

8，CRISPR/Cas9 系统介绍的相关值得推荐的视频。

理论二：CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍

1， sgRNA 设计方法和相关网站介绍

实验一：CRISPR（sgRNA）的在线设计（请自带可无线上网之笔记本电脑或手机）（在线互动

设计演练）

2， sgRNA 设计后挑选 sgRNA 经验和心得分享。

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第一天 下午 13:00-18:00

实验：

1， gRNA oligos 模板退火

2， 退火 gRNA 与线性化 CRISPR/Cas9 载体连接，

3， 连接产物转化到大肠杆菌（DH5α）

4， 转化产物涂板培养

5， 基因编辑质粒 ps330A 和 ps330S 系列如何具体构建和使用。

理论三：CRISPR/Cas9 作为基因编辑工具的实验用处，案例：

1，Cas9 的多功能系统（如 Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的详细介绍。

3， 利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型介绍

3，利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型介绍

第二天 周日上午 9:00-12:00

理论四：利用 CRISPR/Cas9 技术编辑动物细胞系

1， CRISPR/Cas9 质粒细胞转染方法

2， 阳性细胞克隆筛选

3， 基因编辑细胞系的建立

4， 基因修饰情况分析方法

实验：

1， CRISPR/Cas9 重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定，

2， 基因修饰基因组 DNA 模板（转染 CRISPR/Cas9 到动物细胞后提取 DNA）制备

3， 目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物

4， PCR 产物退火变性，T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况

理论五：利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除或敲入小鼠

1，基因编辑工具 CRISPR/Cas9 基本背景介绍

2，sgRNA 设计及其功能验证

3，小鼠受精卵分离和培养

4，CRISPR/Cas9 系统显微注射到小鼠受精卵

5，受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

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6，PCR 和 T7E1 分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

7，基因敲除小鼠基因敲除情况分析

8，CRISPR/Cas9 构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

第二天 周日 下午 13:00-17:00

实验：实验结果的点评与讨论

1， CRISPR/Cas9 载体构建讨论

2， 目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物结果讨论

3， PCR 产物 T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论

4， Sanger 测序鉴定基因编辑结果

1） CRISPR/Cas9 质粒阳性转化子测序结果确认

2） Sanger 测序阅读基因编辑情况

3） 如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型

理论六：利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰大型动物（猪）

1， 利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大型动物（猪）流程

2， 基因修饰大型动物优势

3， 利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

理论七：CRISPR/Cas9 脱靶问题分析

1， 脱靶产生的原因

2， 脱靶检测方法

3， 降低脱靶问题的方法

理论八：

1， CRISPR/Cas9 技术的发展与应用

2， 新基因编辑工具 Cpf1，C2C2 的用法与比较

3， 基因编辑工具的伦理问题

4， 基因编辑工具的应用拓展。

5， 根据学员的研究内容，详细答疑如何使用基因编辑工具。

上海CRISPR/Cas9基因编辑学习班时间，地点培训时间：2017年9月23日-9月24日培训地点：上海中兴和泰酒店会议厅，上海市浦东张江高科科苑路866相关介绍

注意点：建议每人可以带笔记本电脑！ 

【收费标准】

 注册费：2700元每位（注册费包含电子版教材、午餐，欢迎晚宴费用，住宿费自理。）

优惠措施：

1. 9月 10 号之前确认报名及转账的优惠 200 元

2. 三人组团报名，每人可优惠200元

3.  五人组团参会，领队人可以免费注册！ 

可以开正规会务发票，纸质邀请函（盖红章）。 

 推荐下面三个基因编辑用的质粒可以选择订购，每个质粒500元 （发票单独开）  

      1，ps330A-cas9-sgRNA（可插入任意20bp靶点序列）
      2，ps330S-2-cas9-sgRNA（可用于同时敲除2个靶点的载体）
      3，p-p53-cas9-GFP （可用于小鼠p53基因敲除的载体）

报名方式：

扫描下面二维码识别，即可报名登记！

咨询电话：[phone]

金老师：17701825941

王老师：13818765978

往期上海基因编辑学习班合影

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