基因编辑技术与动物模型构建（网络）精讲班

医药加生物医学科研之家 2022-04-16

【医药加】基因编辑技术与动物模型构建学习班

（网络精讲班）

（ Zoom网络会议，时间：2020.8.08~8.09号）

为帮助正在或打算开展基因编辑与动物模型课题研究的科研人员尽快掌握相关的思路与方法，考虑目前在疫情期间的实际情况，我们决定8.08-8.09号召开【基因编辑技术与动物模型构建学习班（网络精讲）学习班】，为了保证学习效果，我们采用国际顶级的ZOOM网络会议平台授课，效果体验好！

【网络学习班背景】

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。

目前，CRISPR/Cas9系统已经广泛用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。本学习班将详细讲解CRISPR/Cas9基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，将让大家详细了解到具体如何利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。

讲师介绍：这次学习班我们邀请了在基因编辑领域具有丰富实操经验的教授作为主讲人，通过两天的系统学习，能让您熟悉并掌握基因编辑技术与动物模型构建的核心知识点与详细操作技巧。

【讲师背景】

德国慕尼黑工业大学海归博士，具有多年丰富的基因编辑实操经验

参与德意志研究基金委项目(DFG)用于人类癌症研究的转基因克隆猪模型 (SCHN971/3-1)

博士导师为原英国Roslin Institute克隆羊“多莉”团队的Prof. Dr. Angelika Schnieke

成功构建世界上第一头ROSA26双荧光猪模型，极具有生物医学价值(已发表)。随后，成功构建Kras点突变基因修饰克隆猪模型，该模型为构建胰腺癌大动物模型提供了有力工具，为胰腺癌相关靶向药物开发，寻找新的胰腺癌治疗手段等提供了新的动物模型。

【预期目标】

1，掌握基因打靶与基因编辑技术(ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)，能够设计sgRNA靶点，构建CRISPR/Cas9质粒，用于基因敲除和敲入。

2，掌握CRISPR/Cas9质粒转染方法, 阳性细胞克隆筛选方法体系，基因编辑细胞系的建立，基因修饰情况分析方法。

3，掌握CRISPR/Cas9脱靶产生的原因，脱靶检测方法，降低脱靶问题的方法

4，掌握CRISPR/Cas9的实际应用，构建动物模型，对构建基因修饰小鼠和基因修饰大动物（猪）有较深入了解。

5，掌握新基因编辑工具，如：Cpf1, C2C2, base editing等。

6，掌握基因编辑研究领域前沿进展，基因编辑工具的拓展应用、临床应用等，形成利用基因编辑工具结合自己研究内容等科学思维。

7. Base editor 使用方法。

8. 基因编辑工具用于检测新型冠状病毒、基因编辑工具有可能应用于新冠治疗等应用的介绍与拓展

【详细课表】

第一天

周六上午 9:00-12:00

一：基因修饰技术简介

1，基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍

2，基因编辑、基因修饰、基因打靶、转基因、基因敲除、基因敲入等专业领域概念梳理

3，CRISPR/Cas9结构和特点

4，如何使用CRISPR/Cas9系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤），5，拓展如何提高定点敲入效率等知识

6，基因编辑工具Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的结构、特点、工作原理（基因编辑工具知识拓展）

7，如何使用Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14系统进行编辑

8，Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14与Cas9的比较

9，Cas9、Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的应用和技术展望

10，上午现场答疑

周六 下午 13:00-18:00

二：CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍

1， sgRNA设计方法和相关网站介绍

2，CRISPR（sgRNA）的在线设计（在线互动设计演练）

三：基因编辑实验详细操作：

1， gRNA oligos模板退火

2，退火gRNA与线性化CRISPR/Cas9载体连接，

3，连接产物转化到大肠杆菌（DH5α），转化产物涂板培养，CRISPR/Cas9重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定阳性克隆

4，细胞转染（Electroperation，Nuclefection，Nanofection，X-fection）等介绍与应用拓展

5，单细胞克隆筛选（有限稀释法，滤纸法、环法、流式分选法等）方法介绍与应用拓展

四：利用CRISPR/Cas9技术编辑动物细胞系

1， CRISPR/Cas9质粒细胞转染方法，

2，阳性细胞克隆筛选，基因修饰基因组DNA模板快速制备

3，目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物

4， PCR产物退火变性，T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况

五：CRISPR/Cas9关键点总结、归纳、拓展

1， CRISPR/Cas9基因编辑关键知识点归纳、总结和提炼

2， CRISPR/Cas9技术应用拓展（如CAB基因敲入方法等介绍）

第二天

周日上午9:00-12:00

六：利用基因编辑技术构建基因敲除或敲入小鼠

1，基因工程小鼠的详细分类与比较

2，小鼠受精卵分离和培养

3，CRISPR/Cas9系统显微注射到小鼠受精卵

4，受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

5，PCR和T7E1分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

6，基因敲除小鼠基因敲除情况分析

7，CRISPR/Cas9构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

七：利用基因编辑技术构建大动物模型

1，以大动物猪为例，进行详细介绍基因编辑技术在大动物模型中的应用

2，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大型动物（猪）流程

3，基因修饰大型动物优势

4，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

八：利用基因编辑技术构建动物模型的详细案例介绍：

1，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型介绍

2，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型介绍

九：拓展基因编辑技术在其它物种中的应用

周日 下午13:00-16:30

十：实验结果的点评与讨论

1， CRISPR/Cas9载体构建讨论

2，目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物结果讨论

3， PCR产物T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论

4， Sanger测序鉴定基因编辑结果

1） CRISPR/Cas9质粒阳性转化子测序结果确认

2） Sanger测序阅读基因编辑情况

3）如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型

十一：CRISPR/Cas9脱靶问题分析

1，脱靶产生的原因

2，脱靶检测方法

3，降低脱靶问题的方法

十二：基因编辑领域进展大梳理与全面拓展

1，基因编辑技术的应用拓展介绍：SHERLOCK-V1、SHERLOCK-V2等应用于检测方面的拓展，Base editing等

2，结合当下新型冠状病毒热点，基因编辑工具用于检测新型冠状病毒、基因编辑工具有可能应用于新冠治疗等应用的介绍与拓展

3， Cas系列突变体的介绍与应用

4，基因编辑的拓展应用（如应用于杜氏营养肌不良综合征、白内障、消灭蚊子、植物中的应用、细菌中的应用等）

5，基因编辑工具的伦理问题于讨论

培训时间和培训方式

网络班时间：2020/8/08-09 培训方式：Zoom网络会议

网络学习班主办：医药加科研培训中心

学习费用

学费 2600元/每位（两天集中网络授课，互动性好，可开发票，可回放）

优惠政策
1. 疫情过后，可补差价参加医药加线下同名班
2. 参加过医药加同名线下班的学员，只要300元复听费用（推荐新学员的，免收复听费用）
3. 办理了SCI与国自然VIP年卡的学员是免费参加的。
4. 分享到朋友圈并且推荐评论的，可以减免100元

注意：此次课程为线上直播教学模式，ZOOM网络会议平台授课，体验与质量有保证！
报名付费成功后，提前发培训需要应用到的软件与课件，并且指导安装。
参加培训的学员课后可通过微信群继续和老师交流，长期获得指导机会。

可以开正规会务发票或者技术服务费发票。

本次网络学习班报名通道，扫码报名