[观点]华山医院毛颖:液体活检在未来胶质瘤诊治中将占重要地位

神外前沿讯，近日，科学技术文献出版社出版了《胶质瘤毛颖2016观点》一书并授权《神外前沿》转载其部分内容。

本书从胶质瘤的流行病学研究入手，通过分子病理学、基因组学、神经外科新技术(术中磁共振、导航等)应用、脑功能保护等角度全面解析胶质瘤目前基础研究和临床治疗的最新成果。

以下是《胶质瘤毛颖2016观点》一书部分章节摘编之二：

1、什么是液体活检？

液体活检（liquid biopsy）是近年来肿瘤研究领域的新兴理念，包括胶质瘤在内的所有肿瘤均能分泌可溶性物质进入血液、脑脊液，这些物质均从一定程度上反映了肿瘤的特征。深入分析体液中的肿瘤源性物质将便于肿瘤的早期诊断和复发监测。《MIT Technology Review》杂志将恶性肿瘤的液体活检技术列为2015年度十大突破性技术之一。

液体活检是一种快速、简便、非介入性的癌症检测方法。对于大多数肿瘤而言，液体活检是基于简单血液检测的癌症筛查技术，而对于胶质瘤，我们可以将液体活检技术进一步拓展至血液外的其他体液，如脑脊液、尿液等。液体活检可反复、动态监测肿瘤变化，也可以建立肿瘤的基因表达特征谱，同时可以指导靶向药物治疗，预测治疗有效性，从而实现肿瘤治疗个体化治疗策略的实时制订，未来甚至有望替代手术或穿刺活检。

近年来，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）作为一种新型生物标志物引起了越来越多的关注，目前已有报道称在GBM患者的血液中检测到CTC。增殖期或者失活的肿瘤细胞本身有时会脱落至周围体液中，甚至进一步进入循环系统，造成远隔部位转移，这就形成了CTC。相比CTC，更多的情况是肿瘤细 42 35481 42 15046 0 0 870 0 0:00:40 0:00:17 0:00:23 2890释放DNA到周围微环境，并进一步扩散至体液包括血液中，形成了循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。

进入循环系统的蛋白质可通过蛋白组学的方法检测，血清中的ctDNA和miRNA也可通过商品化试剂盒分离。由于大部分RNA稳定性差，容易降解，所以多数情况下只能检测miRNA等比较稳定的RNA。最近发现胞外囊泡（extracellular vesicle，EV），尤其是外泌体（exosome）可作为载体包裹这些游离的分子进行运输，这在一定程度上避免了上述分子短期内被降解。目前的液体活检技术多针对循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA，但由于体液量巨大且不断循环，而肿瘤早期CTC或ctDNA量往往又偏少，所以相关检测仍面临较大难度。相信随着检测技术的提高，检测灵敏度和特异性的增加，液体活检将变得更加容易，更具临床意义。然而这一切同样还依赖于肿瘤特异性标志物。

肿瘤标志物是指仅特异性表达于恶性肿瘤，或由其分泌，或是体内因肿瘤刺激产生的特异性物质。肿瘤标志物通常存在于体液如血液、脑脊液、尿液中，能够反映肿瘤生长情况，可利用免疫学、生物化学的方法检验，帮助进行肿瘤的早期诊断、分类、预后判断及辅助治疗。1845年Bence-jones最早发现骨髓瘤患者尿中本-周蛋白升高，这是最早发现的肿瘤标志物之一。接着，科学家发现部分激素、同工酶和蛋白在肿瘤患者体内发生变化，如Zondek发现HCG是绒毛膜癌的标志物之一。20世纪60～70年代，AFP、CEA等胚胎蛋白性标志物陆续被发现。1975年发现了单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），1979年英国肿瘤发生生物学和医学会议上，肿瘤标志物正式被提出并应用于临床。近来大量的肿瘤标志物陆续涌现，这促进了肿瘤诊断和治疗的发展，目前标志物检查已成为检验医学中不可或缺的一部分，在肿瘤的早期发现和临床随访中发挥重要的作用。但是，寻找胶质瘤特别是高级别胶质瘤的特异性标志物仍然是困扰医学界的一大难题。

2、血液液体活检在胶质瘤诊治中的应用

血液的优点在于方便获得，且创伤较小。血清肿瘤相关蛋白的研究已有时日，前列腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、白血病等均在肿瘤相关蛋白方面有所进展。但在血液循环中，机体各个器官均参与血液成分的代谢，液体活检的结果易受到干扰。另外，因血脑屏障的存在，导致部分重要的蛋白质无法通过，致使无法在血液中发现其变化。XU等利用蛋白组学分析发现胶质瘤患者血浆中的α2-巨球蛋白、CA 199、VII因子、巨噬细胞趋化因子（MDC）和干细胞因子（SCF）发生变化，同时血浆中的MIP-α反映胶质瘤的增殖情况。也有研究发现TIMP1水平在GBM患者的血浆中升高。但总体来说，因为其敏感性和特异性不强，外周血检测胶质瘤标志物目前仍发展缓慢，随着生物技术的进步，外周血检测可能在预测恶性胶质瘤的复发以及抗肿瘤药物的治疗效果方面发挥作用。

我们医院胶质瘤团队利用ELISA和2D western blot技术检测了血液中的GFAP，发现25%的胶质瘤患者血浆中GFAP表达增高，且增高程度与肿瘤级别相关。

GBM的血清蛋白组学研究仍处于发展阶段。最近一项基于表面增强波谱分析的研究发现CXCR4、S100A8和S100A9较有潜力，但结论尚需进一步验证。

另有研究提出了完全不同的蛋白谱，包括结合珠蛋白、甲状腺激素结合蛋白等。利用电化学荧光技术比较不同级别胶质瘤患者和健康人群血清中GFAP、S100、NSE、β-synuclein的水平，未发现明显差异。关于IDH1和IDH2突变能否用于血清学早期检测的问题一直备受关注，但它们的代谢产物2-HG在血清中的水平被证明和IDH1/IDH2的突变情况以及肿瘤的大小并不相关。

EGFRvIII是目前公认的胶质瘤特异蛋白，表达于部分胶质瘤患者中，外泌体中可检测到EGFRvIII，或许能够作为生物标志物帮助EGFRvIII靶向治疗，其临床效用尚待验证。若将来接受EGFRvIII疫苗治疗的胶质瘤患者肿瘤组织中EGFRvIII的变化能通过血清学反映出来，那么EGFRvIII将有望得到更广泛的应用。血管内皮生长因子（VEGF）在胶质瘤的血管新生和恶性进展中发挥重要作用，曾有报道提出胶质瘤患者体液中VEGF水平和肿瘤血管密度成正比，但进一步的研究未能证实其对胶质瘤诊断和疗效评估的作用。

肿瘤细胞外排的ctDNA长度为150～200bp，已有的研究证实包括胶质瘤在内的多种肿瘤ctDNA能够较好地反映肿瘤细胞的各类基因突变如点突变、扩增等。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标志物，并且可以被定性、定量和追踪。包括胶质瘤在内的多种实体肿瘤患者血液中均已发现ctDNA。胶质瘤中常见的IDH1突变、EGFRvIII、MGMT甲基化、1p19q杂合性缺失都可检测到。

ctDNA似乎比CTC更为丰富，在16例未能检测到CTC的肿瘤患者中有13例发现ctDNA的存在。ctDNA的细胞检测阈值约为50×106，远低于影像学可见时的细胞水平。因此，ctDNA的敏感性备受瞩目。ctDNA在血清中的半衰期尚不清楚，有研究发现鼻咽癌患者EB病毒DNA的半衰期＜3小时，这一发现提示ctDNA的动态变化将有望实时反映肿瘤内稳态。鉴于当前各类检测技术的发展越来越迅速，ctDNA的高敏感性和动态变化将有助于血清标本的快速活检。

miRNA是由21～24个核苷酸组成的非编码RNA分子，自2000年被首次发现，至今已有约2000种miRNA被证实存在，其在正常细胞和肿瘤细胞中都发挥重要的调节作用。鉴于其具有癌基因和抑癌基因的作用并参与胞间信号转导，miRNA被认为是EV中最有希望应用于肿瘤诊断及预后的分子。有报道称miRNA可反映组织特异性“指纹”，转移瘤的外泌体中miRNA图谱和原发灶吻合。目前正有临床试验研究miRNA在肾癌和肺癌疗效评价中的作用。GBM肿瘤组织中miRNA对预后和治疗效果的预测作用也已有研究，亚型特异性的miRNA图谱可用于生存期预测。一项基于TCGA数据库的回顾性分析显示，miR-130a和TMZ的疗效呈正相关，且不受MGMT甲基化状态的影响。miR-21是胶质瘤中研究最多的miRNA，Meta分析显示miR-21是胶质瘤诊断中最可靠的可溶性生物标志物，并可用于鉴别假性进展和放射性坏死，miR-21也因此被视为潜在的治疗靶点。

肿瘤细胞进入血液循环形成CTC，有望用于转移性疾病的早期诊断和肿瘤复发的监测。目前，微芯片、qPCR、自动化显微镜系统、端粒酶测定等技术已被用于检测CTC。对于肿瘤组织活检困难的病例，CTC检测显得尤为重要。不同于其他标志物，CTC是肿瘤特征的综合反映，即使单个CTC也可用于基因组分析。CTC可较好地代表同质性肿瘤，但对于异质性较为突出的GBM，在准确性方面仍值得商榷。由于血脑屏障的存在，过去认为胶质瘤不存在CTC，但近些年来胶质瘤的颅外转移案例偶有报道，且几个研究小组最近分别通过不同的方法在GBM患者中检测到CTC。端粒酶测定法在11例胶质瘤患者中检测到8例CTC，而其中5例患者CTC数量较高，甚至可以反映放疗的效果，对放疗敏感的患者接受治疗后CTC显著下降。另一项研究利用GFAP识别外周血单个核细胞中混杂的CTC，发现141例患者中20%可检测到CTC。随着单细胞基因组测序技术的发展，CTC中已可以检测到和来源肿瘤一致的特异性突变，说明CTC可展示肿瘤的基因图谱。单一的GFAP、端粒酶或其他标志物并不能全面反映CTC的真实发生率或异质性，因此，未来若要将CTC引入胶质瘤的常规临床检测，仍需联合多种技术或标志物，并对治疗过程中的细胞亚型进行示踪。目前限制CTC广泛应用的主要问题是其含量的匮乏，在很多患者中，10ml的外周血仅能检测到1个或数个CTC，如此低的含量很难用于疗效评估。此外，CTC和肿瘤干细胞的关系耐人寻味。乳腺癌CTC中有一小部分可表达干细胞标记，这类CTC最常见于已发生转移的病例，且常提示预后不佳。那么，CTC在胶质瘤中是否与干细胞密切相关尚待进一步研究。

3. 脑脊液液体活检成为胶质瘤诊治研究中的新热点

对于中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病，脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）检测具有得天独厚的优势。脑脊液由脉络丛产生，在、蛛网膜下腔和中央管内循环，对营养脑细胞、运除代谢产物、调节酸碱平衡、平衡颅内压、维持脑温等起到了重要作用，CSF对于中枢神经系统疾病的诊断和治疗都至关重要。CSF与血浆、淋巴液性质相似，但又有不同，与血液中的成分有差别的是缺乏胆红素、纤维蛋白原、补体、抗体、胆固醇等。CSF来源并局限于中枢神经系统，与其他器官、体液无相互交叉，检测背景干净，“噪声”低，对于中枢神经系统疾病的诊断特异性强。已有文献报道脑脊液中的分子标志物与帕金森病、痴呆、多发性硬化、肌萎缩性（脊髓）侧索硬化等疾病相关。同时已有多项研究尝试采用胶质瘤患者CSF来检测各项指标，期望达到早期诊断或监测复发的目的。

 有研究利用代谢组学分析胶质瘤患者的CSF，发现乳酸、柠檬酸等代谢产物由于受肿瘤细胞IDH1突变的影响，在GBM患者的CSF中显著增高，并认为其水平与预后相关。

我们医院神经外科胶质瘤团队对胶质瘤的CSF蛋白组学进行了系统文献分析，发现在CSF或肿瘤囊液中有19种蛋白质变化显著，WNT4、GAL、IL-6以及HSPA5等蛋白在不同级别的胶质瘤中存在差异。我们用临床CSF标本进一步证实了IL-6在胶质瘤CSF中的确显著增高。此外，我们还检测了CSF中的B7H1、B7H3，发现高级别胶质瘤和低级别胶质瘤患者CSF中B7H1和B7H3均明显高于正常人，且与肿瘤组织内表达量呈正相关。

我们还与UCSD的Clark Chen教授合作检测了CSF中的miRNA，令我们眼前一亮的是，GBM患者的CSF中miR-21含量接近正常人的10倍，同时miR-21主要存在于EVs中，而肿瘤全切后CSF中的miR-21含量只有术前的1/50。

除此之外，我们还建立了CSF中检测外泌体的技术规范，并从CSF的外泌体中检测到58种miRNA，其中miR-23、miR-150等含量明显高于正常。因此，检测CSF中外泌体的特异性miRNA有望作为诊断胶质瘤的新方法。Mattos-Arruda等利用大规模平行测序技术比较了12例脑肿瘤患者CSF和血浆中的特异性ctDNA，例如IDH1（R132H）、TP53 （R114C）、ANK2 （K2337X），发现CSF敏感性更高，更能有效地反映肿瘤进展及其对治疗的反应。

4、尿液液体活检可能成为胶质瘤诊治的新思路

很早就有学者尝试从尿液中检测相关蛋白来诊断胶质瘤，但进展不大。随着检测技术的提高，检测灵敏度的提升，最近又有人做了新的尝试。2015年的《Oncologist》发表了一篇针对胶质瘤患者血清及尿液检测2-HG的调查报告。代谢产物2-HG分子小，可以在不同体液中被检测到，研究人员已成功证实通过串联质谱（MS/MS）或高效液相色谱法（HPLC）等手段，可快速、简便、无创检测尿液中是否含有2-HG。

报告发现，IDH野生型与IDH突变型患者血清中2-HG的平均浓度无显著性差异，但是二者尿液中2-HG的含量存在显著性差异，IDH野生型患者的浓度明显高于IDH突变型；且血清/尿液中2-HG的比值也存在显著性差异，IDH突变型患者的比值明显高于IDH野生型患者。

两项试验提示，通过检测尿液2-HG可对患者IDH的突变情况作初步判断。此外，有文献证实在其他含有IDH突变基因的肿瘤中，一旦患者接受肿瘤切除术，尿液中2-HG的含量会显著下降，提示尿液检测2-HG是预后评价的潜在指标之一。

5、总结：

由于胶质瘤的异质性，寻找其特异性标志物是一个非常具有挑战性的任务。而无论以血液、脑脊液，还是尿液作为液体活检的来源，其均各具优缺点，并且这些标志物的含量也可能无法准确地反映肿瘤级别，所以液体活检不能取代常规病理检查在诊断和制订治疗策略中的地位。

但总的来说，随着信息时代各种技术的飞速发展和全球对恶性肿瘤研究的日益重视，胶质瘤研究已取得重大进展，但寻找胶质瘤特异性标志物依然任重道远。随着关于各种肿瘤“组学”、“指纹”、“图谱”相关研究的进展，以及新一代测序技术的进步，未来有望联合多项指标来进行液体活检诊断，这可能为胶质瘤诊断带来新的思路。而这些液体活检技术同样可发展为治疗手段，真正实现无创的个体化、实时动态化的胶质瘤治疗。

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作者简介：毛颖，医学博士，师从周良辅院士，复旦大学附属华山医院神经外科教授、主任医师，教育部特聘长江学者，现任复旦大学附属华山医院副院长，华山医院神经外科常务副主任。曾于日本大阪市立大学医学部及美国哈佛大学麻省总医院研修脑血管病和颅底外科的临床诊治，并于美国密歇根大学Crosby实验室进行脑缺血的博士后研究。

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