"传递肽"活体递送Cre重组酶进入小鼠中枢神经细胞 转导效率≥AAV转导！

美国德州A&M大学的研究人员通过简单的联合注射HIV-TAT传递肽成功地将Cre重组酶递送到小鼠体内的神经细胞中并激活皮质的神经元报告基因表达，效率相当/优于腺相关病毒(AAVs)！为研究活体神经细胞瞬时表达（非持续表达）提供了新工具。

摘要

Cre重组酶与HIV-TAT肽的简单共注射能够成功将Cre传递到小鼠神经细胞中，Cre的递送成功激活了大脑皮质中神经元和星形胶质细胞中报告基因的表达，而不会造成组织损伤，其转导效率与常用的腺相关病毒相当或更好。研究数据表明，传递肽介导了有效的内吞Cre细胞的内质渗漏和胞浆逃逸。因此，肽以反式作用，不需要与有效载荷结合，大大简化了样品制备。此外，传递肽完全由天然氨基酸组成，因此容易被细胞降解和加工。这种方法将有助于需要在体内将蛋白质瞬时导入细胞的应用。文章发表在新一期的《SCIENCE ADVANCES》上。

简介

了解中枢神经系统，特别是大脑的生理学，是当前医学界最紧迫的挑战之一。研究细胞在时间和空间、健康或疾病以及神经网络环境中是如何相互作用的是复杂的。它需要新的研究工具，允许在细胞内传递可以报告细胞的探针。颅内立体定向注射病毒，特别是腺相关病毒（AAVs），经常被用于研究体内中枢神经系统（CNS）细胞的操纵和理解。由这些病毒转移的基因可以是荧光报告基因或基因组编辑工具，用于监测和调节细胞过程。AAV仍有一些局限性，包括包装容量相对较低、转基因表达启动缓慢、某些情况的转导效率较低、可能整合到宿主基因组中以及诱导神经炎症反应。

此外，转移基因的持续表达对某些应用是有益的，但对其他应用却有问题。基因编辑实验就是这样，细胞中持续存在的基因编辑机制会导致脱靶的基因组修改。转录因子的表达也往往需要短暂的和瞬时的控制。蛋白质的直接输送可以避免这些问题。蛋白质可以在没有转录/翻译延迟的情况下启动细胞内活动。蛋白质在细胞内的半衰期也有限，因此可避免长期影响。

利用蛋白质作为细胞内传递有效载荷的一个主要限制是目前缺乏将这些大分子高效低毒地引入细胞质的技术。许多递送剂能够促进蛋白质的内吞吸收进入细胞，然而蛋白质的有效载荷通常仍被困在内吞体（endosomes）中。因此，这些蛋白质的有效载荷无法达到胞浆或核靶点，无法诱导所需的生物活性。

人们已经开发出能够选择性渗透晚期内吞体（LE，也作次级内吞体）膜的多肽。这些肽包括细胞穿透肽（CPP）TAT的二聚体dfTAT。当外用给细胞时，dfTAT和蛋白质有效载荷都积累到内吞体室中，然后一起运输到晚期的内吞体，在那里dfTAT介导膜的通透性，并允许蛋白质有效成分逃逸到细胞质中。值得注意的是，dfTAT的使用不需要偶联或绑定到有效载荷上。只要两种分子都被细胞内吞并到达相同的内吞体，胞浆传递就成功了。这种方法与载体系统封装有效载荷并将其携带到细胞（如脂质体和纳米颗粒）的策略明显不同。这种方法的主要好处包括样品制备简单、有效载荷可控、以及能递送化学和功能上未改变的“原装”蛋白质。

这种策略虽然在体外细胞培养环境中有用，但是否能在体内发挥作用尚不清楚，因为传递剂和“货物”可能在组织中彼此扩散，并分别到达不同的细胞。此外，体外组织培养和体内应用的一个主要区别是细胞暴露于传递剂和“货物”的时间。在组织培养中，传递剂和货物的浓度是相对恒定的，而在体内，由于固有的药代动力学特性，这些浓度可能会发生变化。可以预计，这种差异将对递送和毒性会有重大影响。考虑到体外和体内方法之间的这些关键差异，研究人员在本研究中的目标是在立体定向颅内注射的情况下探讨这种细胞穿透肽有效性，建立一种与AAV转导一样有效的体内蛋白质输送方法的可行性。这项技术允许使用基于蛋白质的工具和探针来操纵和研究体内组织生理学。未来将探讨这种方法作为一种治疗应用的潜在可能，因为它比病毒递送和当前最先进的有效载荷递送具有独特优势。

结果

蛋白质转导的好处之一是它们在细胞内迅速起作用，随后被清除，不会产生长期的有害影响。在这种情况下应该使用一种传递工具，这种工具一旦进入细胞就会迅速降解，几乎没有残留。

dfTAT是一种在细胞渗透期间和之后迅速降解的肽。起初的dfTAT含有两个拷贝的羧四甲基罗丹明（TMR，一种荧光基团），可以在显微镜下观察细胞穿透过程和机理研究。为避免运输过程和降解后的荧光物质积累，研究人员尝试开发dfTAT类似物——不含细胞外来物质并分解成天然氨基酸。然而，初步测试表明，简单地从dfTAT中去除TMR得到产物没有传递能力，他们推测TMR的相对疏水性可能与dfTAT的内质膜破坏活性有关。他们合成了一个具有d(X)TAT一般结构的类似物库，其中“X”是疏水残基，包括短的疏水肽序列，肽加速序列Pas（氨基酸序列：FFLIP）和一种从人乳头瘤病毒33型衣壳蛋白L2（氨基酸序列：YFIL）衍生的肽——先前已被鉴定可增强CPPs的细胞渗透性。为了评估这些肽的传递活性（这些肽在荧光显微镜下无法直接看到，不像dfTAT那样能直接观察到），将TMR-k5作为指示剂，与d(X)TAT（为防止肽在细胞中的蛋白水解降解，用d-赖氨酸残基，用小写字母表示）共同使用。TMR-k5容易被细胞内吞，但缺乏自身的内吞体逃逸活性，一旦TMR-k5进入细胞胞浆后会分布于整个细胞质，到达细胞核，染色核仁。利用这一确认细胞内通路的独特特征，对在d(X)TAT试剂存在下显示荧光核仁的细胞数量进行计数。用带有TMR-k5染色细胞核的细胞百分比作为衡量每个d(X)TAT肽的相对传递效率的代表（TMR-k5的检测本身取决于所用显微镜的检测阈值和孵育期间使用的TMR-k5浓度）。采用SYTOX排斥试验评估肽毒性，并排除死亡细胞。检测结果表明，含有两个连续亮氨酸残基的d(LL)TAT重现了dfTAT的传递活性，而一些肽（X=WW、FFLIP和YFIL）总体上比dfTAT活性更高5-10倍。d(X)TAT肽在其单体形式下失去活性。这表明，从结构-活性的角度来看，“X”位置和二聚作用都调节肽的传递活性。值得注意的是，d(X)TAT肽在高百分比细胞中实现胞浆传递的浓度下显示出很少的细胞毒性。作者选择d(LL)TAT和d(WW)TAT作为具有中、高传递活性的d（X）TAT肽的代表性成员进行后续研究。

为了进一步验证这些结果，作者评估了这些传递肽对基因修饰酶Cre重组酶的传递作用。结果表明d(X)TAT并不改变TAT-Cre的内吞摄取水平，而只是导致蛋白质从内吞体重新分配到细胞核。d(X)TAT肽使TAT-Cre能够以与病毒转导Cre相似的水平将TAT-Cre输送到体内细胞的胞浆和细胞核中。

讨论

作者提出了一种新的非病毒的方法，能有效地将蛋白质输送到中枢神经系统的细胞中。这种方法包括一种简单地与蛋白质有效载荷混合的多肽。作者使用有效载荷Cre重组酶作为一种工具，在基因修饰的生物体中空间启动基因表达，证明这种方法在激活tdTom表达方面与AAV基因传递方案一样有效。这种方法提供了一些潜在的好处：（i）它允许细胞内生物活性的快速启动（例如，Cre酶以其活性形式传递并在进入细胞后迅速诱导重组，而AAV2-Cre则需要一段时间延迟以使Cre重组酶从细胞中表达出来Cre基因）。（ii）蛋白质直接和短暂地传递到细胞中，在转录因子或基因编辑工具的背景下，可以潜在地避免因长时间表达而引起的不必要的非靶向和连锁效应。（iii）通过标准的固相肽合成和重组技术，可以直接生产传递肽和蛋白质有效载荷，这大大减少了与病毒策略相关的生产时间和成本。（iv）递送方法不涉及与宿主基因组DNA整合相关的潜在风险。请留意这种方法提供了有别于AAV的一种选择，而非替代。

运送非AAV包装的有效载荷（例如，DNA>5 kb、mRNA或长的非编码rna、大型转录调节器等），各种蛋白质、肽、寡核苷酸、不渗透细胞的小分子和大的纳米颗粒（直径约100纳米）已成功地通过dfTAT共沉淀法被输送到细胞中。值得注意的是，以前的研究也通过在体内传递Cas9核糖核蛋白或Cre重组酶实现了CNS的基因编辑，然而这些方法需要用可能干扰蛋白质功能的融合标签对蛋白质进行修饰，并使用脂质基转染剂，这些药物可能会在细胞内长期存在并引发多种细胞反应。相比之下，这里使用的CPPs可以在交付后迅速降解（dfTAT已经被证实对细胞生理学几乎没有影响），并且蛋白质货物不需要修改，传递肽的这些特征有望为将来研究体内基因编辑应用带来益处。（更多讨论请查看原文）

参考文献

In vivo peptide-based delivery of a gene-modifying enzyme into cells of the central nervous system