方法论 | 肠道菌群研究7大要素，轻松get！
今天科技君和大家聊一聊时下最热门的肠道菌群研究方法——宏基因组关联分析（Metagenome-Wide Association Study, MWAS），还不知道MWAS是什么的童鞋戳这里：
以下是MWAS研究的7大要素，科技君来为大家分步解析。
MWAS研究适用群体[1]：
1） 疾病组／健康组：研究健康人群和疾病人群之间的差异，寻找与疾病相关的marker，这是目前最典型的MWAS研究群体；
2）药物或饮食干预的群体：结合药物疗程或饮食干预周期进行群体选取，比较个体在不同干预阶段的微生物菌群差异；
3）生长发育时期的群体：如选取婴儿出生后0个月、4个月、12个月的粪便样本进行婴幼儿肠道菌群研究[2]；
4）不同疾病发生发展进程的群体：如分别选择健康人、结直肠腺瘤患者（大部分的结直肠癌由腺瘤演变而来）、结直肠癌患者群体，研究与结直肠癌疾病进程相关的marker[3]；
5）同一群体多个身体部位微生物研究：如类风湿性关节炎研究中分别选取粪便、唾液、牙菌斑样本进行关联分析[4]。
1）粪便样本：
取样建议：收集新鲜粪便中段样品,同一样品可分装成小份（可每管收集分装 1 克），取样完毕后盖上盖子旋紧，尽可能保持样品处于厌氧环境（如有条件可以 使用厌氧袋），置于 0℃以下如冰盒运回实验室；如不能立即进行核酸提取，将粪便样品迅速置于-80℃冰箱保存，每次取一小份进行提取，避免反复冻融。
也可选取含缓冲液的采集器，室温或4℃运输；推荐样本采集器OMNIgene•GUT （genotek），请严格按照采集器操作说明采样运输。
推荐提取试剂盒：
QIAamp DNA Stool Mini kit (Qiagen)
E.Z.N.A.® Stool DNA Kit（OMEGA bio-tek）
2）唾液样本：
取样建议：取样前30分钟，不要吃东西／喝水。取样前，饮入约50ml清水充分洗漱口腔约10秒，吐掉；收集唾液至专用的唾液收集管或15ml管（推荐5ml），不要将管内装满，以免冷冻后将样品管涨裂。取样后直接置于-20℃储存；如不能立即进行核酸提取,请将样本置于-80℃冰箱保存。
也可选择含缓冲液的采集管，室温或4℃保存／运输；推荐样本采集器OMNIgene•ORAL (genotek)，请严格按照采集器操作说明采样运输。
推荐提取试剂盒：
QIAamp DNA Mini kit (Qiagen)
3）其他样本
除肠道和口腔外，MWAS研究也可以选择黏膜、皮肤、生殖道、胎盘等取样部位。不过这类样本一般样本量少，取样较为困难，且宿主污染较多，往往难以满足宏基因组研究需求。
*DNA样品要求: 基因组DNA，无降解或轻微降解；样品总量m≥1.5μg（推荐m≥3μg）；样品浓度c≥20ng/μL。
在样本较难获取的情况下，也可以选择微量建库。
测序策略：推荐构建350bp文库，PE151测序，5G/样本数据量。
De novo组装：选用合适的组装软件对测序reads进行de novo组装。测序质量和序列长度直接影响组装结果和后续分析。
可选组装软件：Soapdenovo, MetaVelvet, IDBA, MEGAHIT, metaSPAdes。
1） 构建参考基因集：对de novo组装结果进行基因预测，将不同样品预测出的基因合并在一起进行聚类并去除冗余序列，得到非冗余基因集。
2） 丰度定量：将测序reads比对回参考基因集并计算每个基因的丰度。基因丰度定量的结果是物种定量、功能定量的基础。
对于样本量小的项目，建议直接选用公开的基因集，如人肠道参考基因集(IGC)[20,21]。
整合人肠道参考基因集（IGC）构建。
对三个不同群体1200多个人体肠道微生物样本进行宏基因组测序，并整合部分已发表的人肠道微生物基因组信息，最终得到将近10M的人肠道参考基因集。
MWAS分析的一个重要目标就是寻找和疾病关联的物种。目前，物种注释和定量的方法有多种，从原理上可以分为两大类：
1）基于全基因组
基于全基因组的方法需要找到一个物种的基因集合，一般通过基因聚类实现。来源于同一个细菌基因组的基因存在着物理性关联（physically linked），例如有相似的丰度信息。生物信息分析上，可以利用这一信息对基因进行聚类，找到同一物种或分类单元的基因集合。根据相关算法的区别，目前常用的基因聚类方法有：MLG（metagenomic linkage group）[1]和MGC（metagenomic cluster）或MGS（metagenomic species）[5]。另外，序列的组成信息如GC含量、核苷酸出现频率也是基因聚类的参考特征（这种情况在小样本项目中普遍存在）[2,7]。该类方法资源消耗大，对算法要求高，但是可以同时研究已知和未知物种。
基于MGS的物种注释及组装。
宏基因组测序—基因丰度分析—MGS/CAG聚类—MGS特异性reads组装。
2）基于特殊（标记）基因
保守的单拷贝基因或菌种特异性的基因区域更有利于进行物种注释（如mOTU[6]法可得到比16S测序更准确的物种注释结果）。基于标记基因的优点是资源消耗小，能快速获取物种定量信息，但对未知物种的区分能力有限。
宏基因组关联分析可以挖掘多个层面的信息，包括基因、功能和物种，并构建样品分类模型，对新样品进行预测。华大基因宏基因组关联分析主要分析点包括以下内容：
1）非监督聚类分析：挖掘数据的固有模式（如肠型）；
2）多元统计分析：识别跟分组显著相关的因素（如疾病状态、药物干预等）；
3）差异检验：识别组间差异物种或差异基因；
4）功能分析：显著代谢通路分析，识别差异代谢通路或模块单元；
5）分类模型构建： 基于差异分析结果，挑选跟样品分类最相关的生物标记物，通过交叉验证构建出扩展性良好的分类器，并对新样品进行预测。
MWAS研究的意义不仅在于发现微生物标记物，更在于其他群体的相互验证，为深入的疾病机理研究提供指导。MWAS分析找到与疾病相关的基因或物种，但因果关系及作用机制还需要进行严谨的实验进行验证。目前常用的验证方法如下：
1） 扩大群体验证（Additional cohort）
扩大样本群体可减少技术本身造成的误差（二型糖尿病、类风湿性关节炎、结直肠癌的研究都采用了这种验证方式）[2-4,8]。
然而，与人体（宿主）基因组不同，人体微生物组在不同人群中差异较大，这对后续的验证工作带来了较大困难； 另外，不同的群体由于地理位置、饮食习惯、BMI及年龄的不同往往会导致验证结果的差异，这也是MWAS结果验证的另一技术难点。
随着越来越多的MWAS研究数据的积累，扩大群体验证或者不同群体间的交叉验证有望成为MWAS研究的常规程序。未来对数据共享和数据标准的需求也将越来越高。
2） 时间纵向研究（Longitudinal cohorts ）
时间纵向研究可对同一人群进行不同时间点研究，分析疾病发生发展过程人体微生物和疾病的相互关系，发现和疾病发生具有因果关系的物种/基因/功能。人群纵向研究也可以用于比较干预前后人体微生物的改变（如饮食干预、药物治疗和菌群移植）[14,9,10-13]。
3） 实验验证
动物实验
动物实验可以通过严格的实验设计，控制环境因素及宿主因素对结果的影响，有利于大量生理生化指标的检测。目前最常用的实验模型是无菌小鼠，另外特定病原缺陷的小鼠也可被用来作为动物模型（该模型的制备更有挑战性，结果更具有转化价值）[13,14]。
体外功能验证
通过MWAS分析可以得到与疾病相关的marker，但是要明确这些marker的作用机制还需要更深入的体外功能研究。目前常见的体外功能研究方法包括：特定菌株的微生物学研究，菌群间相互作用研究以及菌群和宿主（分子、细胞或组织）的相互作用研究[15-19]。
4）多组学交叉验证
宏转录组学、宏蛋白组学以及代谢组学的发展，可实时检测人体内生物marker的活动状态，也将为宏基因组学研究提供更多的支持。
以上宏基因组关联分析的七大要素，您get 到了吗？科技君抛砖引玉，更多疾病与人体微生物的复杂关系等您来发现！
参考文献：
1.Wang J, Jia H. Metagenome-wide association studies: fine-mining the microbiome[J]. Nature Reviews Microbiology, 2016, 14(8): 508-522.
2.Bäckhed F, Roswall J, Peng Y, et al. Dynamics and stabilization of the human gut microbiome during the first year of life[J]. Cell host & microbe, 2015, 17(5): 690-703.
3.Feng Q, Liang S, Jia H, et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma–carcinoma sequence[J]. Nature communications, 2015, 6.
4.Zhang X, Zhang D, Jia H, et al. The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment[J]. Nature medicine, 2015.
5.Nielsen H B, Almeida M, Juncker A S, et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(8): 822-828.
6.Sunagawa S, Mende D R, Zeller G, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes[J]. Nature methods, 2013, 10(12): 1196-1199.
7.Albertsen M, Hugenholtz P, Skarshewski A, et al. Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes[J]. Nature biotechnology, 2013, 31(6): 533-538.
8.Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J]. Nature, 2012, 490(7418): 55-60.
9.Cotillard, A. et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness. Nature 500, 585–588 (2013).
10.Xu, J. et al. Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula. ISME J. 9, 552–562 (2014).
11.Lukens, J. R. et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature 516, 246–249 (2014).
12.Hsiao, E. Y. et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155, 1451–1463 (2013).
13.Atarashi, K. et al. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature 500, 232–236 (2013).
14.Lee, S. M. et al. Bacterial colonization factors control specificity and stability of the gut microbiota. Nature 501, 426–429 (2013).
15.Lukovac, S. et al. Differential modulation by Akkermansia muciniphila and Faecalibacterium prausnitzii of host peripheral lipid metabolism and histone acetylation in mouse gut organoids. mBio 5, e01438-14 (2014).
16.Kim, K., Lee, S. & Ryu, C.-M. Interspecific bacterial sensing through airborne signals modulates locomotion and drug resistance. Nat. Commun. 4, 1809 (2013).
17.Cuskin, F. et al. Human gut Bacteroidetes can utilize yeast mannan through a selfish mechanism. Nature 517, 165–169 (2015).
18.Stowell, S. R. et al. Microbial glycan microarrays define key features of host-microbial interactions. Nat. Chem. Biol. 10, 470–476 (2014).
19.Wang, X. et al. Cloning and variation of ground state intestinal stem cells. Nature 522, 173–178 (2015).
20.Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. nature, 2010, 464(7285): 59-65.
21.Li J, Jia H, Cai X, et al. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(8): 834-841.
撰稿：张 义
编辑：市场部
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