给力！基因克隆“奔小康”竟是因为它
我们知道，动植物群体类型多种多样包括作图群体、自然群体、突变体等，根据群体类型不同有很多的定位方法检测目标性状的候选基因区间。获得真正影响性状的基因并将其克隆，是将定位结果用于育种或其他研究的重要步骤。那么怎样获得候选区间，如何进行基因克隆呢？其次，对于有或无参考基因组的物种进行基因克隆难度完全不在一个水平上，这个问题今天由科技君为您解答。
图1 植物QTL定位到基因克隆[1]
基于家系或种质资源利用连锁分析或关联分析定位QTL，然后获得候选基因。图中BAC代表BAC文库；GS代表基因组序列 ；LD代表连锁不平衡；MM代表分子标记； NILs代表近等基因系；Ph代表表型；
Prb代表转基因研究；Str代表群体结构信息；Sy代表共线性；Reverse genetics包括转基因、
activation tagging、TILLING和RNAi等。
有参考基因组的物种根据基因组注释信息，可以获得目标区域包含的基因并进行相关基因的功能注释，根据已有研究基础筛选目标基因并进行基因功能的验证。对于没有参考基因组的物种，初定位以后要精细定位，定位到一定区间以后只能构建BAC等大片段文库进行基因克隆，从初定位到精细定位到BAC文库构建每一步都需要投入大量的时间和精力，耗时耗力，相对于有参考基因组物种进行基因克隆难度增加了何止一点点。
图2 有/无参考基因组物种基因克隆流程
利用家系群体进行基因初定位，通过构建次生群体或是针对目标区域进行关联分析精细定位。家系群体有明确的等位基因和等位基因频率，不存在群体结构，在这样的群体中定位结果不存在因群体结构引起的假阳性。对于有参考基因组物种，根据基因组注释信息，可以获得目标区域包含的基因并进行相关基因的功能注释，根据已有研究基础可筛选目标基因。
文章一[2]
2016年10月，《PNAS》发表了一项研究，在水稻中确定了两个关键的淀粉合成酶基因，它们共同调节着抗性淀粉（RS）的生物合成。食用抗性淀粉（RS）含量高的食物，可以帮助控制糖尿病。RS含量高的食物也有预防病原体感染、腹泻、炎症性肠道疾病、结肠癌和慢性肾脏、肝脏疾病的潜力。
研究中利用γ辐射杂交水稻保持系R7954并鉴定到一株高RS的突变体b10，R7954和b10杂交构建F2群体，发现子代低RS和高RS符合3:1分离比，推断有个单基因功能缺失导致高RS表型。通过基因定位检测到该基因位于chr8，在412个样本中进行更大规模的连锁分析，在456kb区间定位到一个基因，利用基因组数据库信息，发现此区间有76个蛋白编码基因，其中一个基因编码可溶性淀粉合成酶（SSIIIa; LOC_Os08g09230）。R7954中的基因SSIIIa约10kb，包含16个外显子、5367个碱基编码1788个氨基酸，比较R7954和b10间SSIIIa差异，发现在b10第5个内含子的3’剪接位点有个G到A的突变，引起SSIIIa编码序列4bp的缺失和移码突变导致提前终止。b10的cDNA测序结果证明了这个新的剪切位点的存在。通过将15.6kb包含有SSIIIa 基因全长的野生型基因组片段导入b10；RNAi抑制R7954中SSIIIa基因表达；并利用光学显微镜观察稻粒形状和籽粒的物化特性；发现SSIIIa基因调节水稻中RS合成并影响稻粒品质和淀粉的物化特性。同时研究还发现SSIIIa基因影响RS含量亦需要编码颗粒结合淀粉合成酶的waxy基因高表达。
图3 文章一研究思路
GWAS分析利用自然群体进行基因定位。无需构建群体，节约群体构建时间；可同时对同一个基因座的多个等位基因进行分析；利用自然群体长期进化过程中累积的重组信息，定位结果分辨率更高，甚至可以直接定位到基因本身。有参考基因组物种，根据基因组注释信息，可以获得目标区域包含的基因并进行注释，根据已有研究基础筛选目标基因。
文章二[3]
亚洲栽培稻划分为两个亚种：indica（籼稻）和japonica（粳稻）。粳稻在中国南部最早由一小撮野生稻进化而来，而籼稻衍生自粳稻栽培种和其他的 O. rufipogon生态型杂交。粳稻和籼稻无论是在形态上、遗传上都存在着区别。典型的籼稻粒长、温带粳稻粒短偏圆。 但是典型的热带粳稻比温带粳稻籽粒大，这些形态差异的遗传基础现在还不知道。
本研究通过对381份粳稻材料（包含40份热带粳和341份温带粳稻）的粒长和千粒重开展全基因组关联分析 (GWAS)，定位到一个既控制粒长又决定千粒重的关键数量性状位点QTL-GLW7，并进一步整合基因组变异和全基因组基因表达谱信息，以及水稻突变体材料的分析和转基因实验鉴定，最终成功克隆到控制水稻粒长和粒重的关键基因GLW7。研究发现，GLW7为编码一类高等植物特有的SPL转录因子基因，因此被命名为OsSPL13。该基因在穗发育及颖壳发育时期特异性表达，但是GLW7在大粒型水稻材料中的mRNA和蛋白表达量均显著高于小粒型品种材料。
转基因实验表明，该基因不仅可以使水稻籽粒增大，同时还能显著增加穗长、一级枝梗和二级枝梗数目以及每穗粒数，最终增加水稻产量。研究发现并证明GLW7主要是通过增加细胞的大小而使籽粒的体积变大。进一步群体遗传学分析发现，在水稻的遗传改良过程中，大粒基因GLW7是从籼稻通过遗传漂移渗透到热带粳稻以及少量的温带粳稻中，从而改良了粳稻的千粒重和产量。
图4 文章二研究思路
有参考基因组的物种，知道目标区域后可以获得候选基因信息，那么没有参考基因组的物种要怎样进行基因克隆呢？我们看看在基因组公布前，这些动植物是怎么做的？
文章三[4]
在牛的参考基因组还没有发布时，研究人员在牛14号染色体着丝粒末端定位到一个影响牛奶组成，特别是脂肪含量的QTL，然后通过连锁不平衡分析利用微卫星标记将该QTL定位到标记BULGE13和BULGE09之间的3cM区间内，基于此正向进行基因克隆。首先构建跨越相应标记间隔的BAC contig，然后在该contig中获得一个候选基因DGAT1并发现在DGAT1基因上非保守性的K232A置换对乳脂含量和其他的其他乳品特性具有主要影响。
图5 文章三研究思路
从上面介绍可见，参考基因组对于基因克隆是有多大的助益啊！向仲怀院士曾说过：“一个物种基因组计划的完成，就意味着这一物种学科和产业发展的新开端”，从现在的研究现状可以看出这已经成为现实。测序技术和信息分析方法的不断发展为破译基因密码提供强大助力。我们华大希望和您一起努力，探索生命奥秘。
参考文献
[1]Salvi S, Tuberosa R. To clone or not to clone plant QTLs: present and future challenges [J]. Trends in plant science, 2005, 10(6): 297-304.
[2]Zhou H, Wang L, Liu G, et al. Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016: 201615104.
[3]Si L, Chen J, Huang X, et al. OsSPL13 controls grain size in cultivated rice[J]. Nature Genetics, 2016, 48(4): 447-456.
[4]Grisart B, Coppieters W, Farnir F, et al. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition[J]. Genome Research, 2002, 12(2): 222-231.
撰稿：小 萍
编辑：市场部
近期热文
请继续关注“华大科技BGITech”公众号，
科技君将一如既往地为您提供精彩内容！
如有相关问题，欢迎后台留言~~
▼
关注华大科技，尽享精彩科研！