组织器官发育转录谱的构建策略｜干货

时间让生命表达有丰富的可能性，在不同组织、不同发育阶段，生物体内的基因表达都是特异的。通过转录组测序，完成对动植物生命周期不同阶段的转录图谱描绘，可以全面了解每个组织/器官的基因表达情况，同时获得不同样本中可变剪接的差异信息，加深了解动植物组织/器官发育过程中的基因表达变化，挖掘调控发育的分子机制。

今天科技君将为大家介绍一套研究方案，如何利用转录组测序构建组织器官发育转录图谱。

方案设计

注意事项

1.为了构建完整的、高质量的转录图谱，建议选取多个关键组织/器官材料，并设置多个关键发育时间点；

2. 对于无参考序列物种，推荐转录组测序；对于有参考序列物种，可以选择转录组测序或者RNA-Seq（定量）测序策略；

3. 选择RNA-Seq定量产品，只能进行定量分析，不可以分析可变剪接；

4. 转录组测序策略：PE100/PE150；RNA-Seq定量测序策略：SE50；

5. 实验设计建议至少2个生物学重复，3个以上的生物学重复更好；

6. 对于无参考序列的物种，需要对所有样本的转录组测序结果进行拼接，从而得到该物种的参考序列；对于有参考序列的物种，分析基于对参考基因组的比对进行；

7. 也可以选择数据库中已有的转录组数据进行分析。

经典文献分享

案例一：转录组测序构建亚麻荠发育图谱^[1]

研究材料

为了全面研究亚麻荠基因表达的变化情况，选取4个重要发育阶段、12个不同组织样本进行了转录组测序，包括早期生长阶段（种子萌发、子叶）、营养生长（幼叶、根、茎、老叶）、花的发育（花蕾、花）、种子发育（初期、早中期、晚中期，晚期），每个组织做了3个生物学重复。

研究方法

转录组测序（PE100），总测序量为73Gb，每个组织平均61Mb的Reads。

研究结果

1. 通过转录组测序，不仅发现亚麻荠基因组注释的基因中有88%是表达的，而且提供了亚麻荠发育过程中时空表达模式的全景图，具体结果见图1。

图1 亚麻荠不同组织中的基因表达情况

2. 传统的差异表达基因分析结合WGCNA分析，不仅揭示了不同组织基因表达模式的差异与相似之处，而且发现组织特异表达基因以及网络模块，具体结果见图2和图3。

图2  亚麻荠不同组织中的条件特异表达基因数目

图3 亚麻荠共表达网络分析（WGCNA）

3. 对12个组织中的转录组数据采用ASTALA-VISTA软件进行分析，发现了276,275种可变剪接现象，这些可变剪接按照类型进行统计，具体结果见图4。其中内含子保留是最主要的可变剪接类型，和其他植物中的可变剪接结果一致。

图4 亚麻荠样本中可变剪接类型的统计

4. 可以通过eFP browser数据库查看亚麻荠发育过程中基因表达情况，具体结果见图5。全面的亚麻荠转录组分析将提供全面的基因组研究资源，将会为后续的亚麻荠基因功能研究及调控网络研究提供基础。

图5 通过eFP browser查看亚麻荠发育过程中基因表达情况

案例二：构建全面的陆地棉发育图谱^[2]

研究材料

为了全面研究陆地棉发育过程中的基因表达情况，本文选用了21个不同组织、器官、发育阶段的样本。每个类型的样本都来源于3个不同的植株，混合后检测。

1) 种子萌发阶段：子叶（Y1-1）、幼根(Y1-2)、胚轴（Y1-3）;

2) 叶片发育阶段：新叶（Y2-1）、老叶（Y2-2）、子叶（Y2-3）、茎（Y2-4）;

3) 叶片成熟/衰老阶段：新叶（Y3-1）、老叶（Y3-2）、铃壳0 dpa（Y7-1）;

4) 花发育阶段：花冠（Y4-1）、苞片（Y4-2）、花萼（Y4-3）、雄蕊&雌蕊（Y4-4）;

5) 种子/胚珠发育阶段：胚珠 0 dpa（Y5-1）、胚珠10 dpa（Y5-2）、胚珠20 dpa（Y5-3）、胚珠30 dpa（Y5-4）;胚珠40 dpa（Y5-5）;

6) 纤维发育阶段：10 dpa（Y6-2）、20dpa（Y6-3）。

研究方法

构建链特异性转录组文库，采用PE125测序，每个样本获取至少5G数据量。

研究结果

1. 通过对21个组织样本进行转录组测序，最后得到29,541个unigenes和 56,754个转录本，转录本的平均长度为2,004nt，80%的转录本长度大于1,000nt；另外FPKM的均值为23.38，具体结果见图6。

图6 21个样本中转录本长度分布及表达量统计

2. 为了解不同组织样本的关系，基于表达量的相似性，对21个不同发育阶段的样本进行了层次聚类分析和MSD分析。不同组织样本的聚类范式符合预期，暗示样本间的差异可以通过基因表达的模式进行区分，具体结果见图7。

图7 不同发育阶段的样本的聚类分析谱系图和多维标度图（MSD）

3. 器官/组织特异表达基因的鉴定，可以帮助解释器官/组织的功能及调控机制。种子萌发阶段、叶片发育阶段、叶片成熟/衰老阶段、花发育阶段优先表达的基因在本研究中均被鉴定了，具体结果见表1和图8。

表1 不同发育阶段的器官特异表达基因的统计表

图8 4个不同发育阶段的差异表达基因的Circos图

4. 10dpa和20dpa是纤维发育的关键阶段，所以文章聚焦比较了两个重要的纤维发育时期和其他阶段的差异表达纤维相关的基因情况。最后发现在纤维发育阶段，341个基因表现出上调，749个基因表现出下调，具体的结果见图9。

图9 纤维发育阶段差异表达基因热图

5. 对棉花种子不同发育阶段的样本进行差异基因维恩图分析，发现24个基因是上调的，6个基因是下调的；将种子发育阶段（ovules at 0, 10, 20,30 and 40 dpa）和其他阶段进行比较分析，发现基因是差异表达的，具体结果见图10。

图10 棉花种子发育阶段的差异表达基因的维恩图和热图

6. 为了查看棉花不同发育阶段基因表达的全面动态模式，采用STEM算法进行基因表达聚类分析。具体结果见图11。

图11 时间序列分析（STEM）

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参考文献

【1】Kagale S, Nixon J, Khedikar Y, et al. The developmental transcriptome atlas of the biofuel crop Camelina sativa. Plant J. 2016 Dec; 88(5):879-894. doi: 10.1111/tpj.13302.

【2】Ma L, Wang Y, Yan G, et al .Global analysis of the developmental dynamics of Gossypium hirsutum based on strand-specific transcriptome. Physiol Plant. 2016 Sep; 158(1):106-21. doi: 10.1111/ppl.12432.

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撰稿：吴蔚瑶

编辑：市场部

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