加了“标签”的三代转录组到底有什么不一样？

图1 UMI三代转录组——确认过标签，是真的转录本

给全长转录组加上一个标签（UMI），就可以多得到20%以上的有效数据，实现转录本绝对定量（图1）。

这个“标签”真有这么神奇吗？知道您肯定有很多疑问，今天，科技君就来带您深挖 “标签”背后的秘密。（下文中UMI等同于“标签” ↓↓↓）

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“三代转录”VS“UMI三代转录组”

三代转录组基于三代测序超长读长优势，在测序过程中，无需打断，直接对polyA+DNA进行反转录得到cDNA，然后通过cDNA扩增，哑铃型文库构建，sequel测序，信息分析，最终得到全长转录本序列。在信息分析阶段基于转录本序列信息和reads数进行相关的分析。

UMI三代转录组的实验步骤与目前的三代测序完全一致的，区别仅在于反转录阶段对每一个转录本分子都添加了分子标签（UMI），信息分析阶段通过识别转录本序列和UMI来进行转录本定性和定量分析（如图2）。

图2 UMI三代转录组流程图

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UMI三代转录组可检测到更多新转录本

图3 UMI三代转录组可发现更多低丰度新转录本，

并减少扩增/测序错误引入的假阳性

从图3可以看出， UMI三代转录组可检测到更多的新转录本，主要是因为有UMI和无UMI的情况下，新转录本判断标准不同。

判定某一条转录本为新转录本需要满足两个条件：（1）与参考基因集比对结果显示为新转录本；（2）有一定的拷贝数支持（在无UMI的情况下，有3个以上拷贝支持才将该转录本判定为可靠的新转录本；在有UMI的情况下，有2个以上UMI支持即将该转录本判定为可靠的新转录本）。

基于以上标准，在目前测序饱和度较低的情况下，UMI三代转录组可得到更多的新转录本。随着测序数据量的增加，这一差别可能会逐渐减小。

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UMI三代转录组新转录本结果更可靠

如图3所示，在无UMI的情况下，基于拷贝数进行新转录本判断，有可能会将一些扩增/测序错误的序列误判为新转录本。而UMI三代转录组基于UMI种类进行判断，要求新转录本有两个以上UMI支持，即要求原始样本中有两条以上序列支持，大大降低了扩增/测序错误引入假阳性的可能，得到的新转录本结果更可靠。

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UMI三代转录组可实现转录本绝对定量

图4 UMI三代转录组可实现绝对定量

虽然测序中没有信号放大过程，但三代转录组建库过程中是存在扩增步骤的。由于PCR偏向性，建库过程中转录本可能会存在扩增不平衡的情况（即有的序列扩增效果好，有的序列扩增效果差），导致最终定量结果与真实情况不符，这也是目前限制三代转录组定量研究的一大因素。

UMI三代转录组在反转录阶段对每一条转录本序列都加上UMI，最终基于UMI种类进行定量。在测序达到饱和的情况下，可以根据UMI种类直接“数出“原始样本中的转录本数目，实现转录本的绝对定量。在测序数据量不饱和的情况下，UMI也可以用于校正PCR扩增不平衡，得到更准确的相对定量结果。

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撰稿：张   义

编辑：市场部

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