对抗棉花“癌症”，这篇文章提供了新思路 | 文献解读

编者按

1月4日，由中国农业科学院农产品加工研究所与华大基因合作完成的文章《Population Genomics Demystifies the Defoliation Phenotype in the Plant Pathogen Verticillium dahliae》，发表在《New Phytolgist》杂志上。

大丽轮枝菌（V.dahliae）是引起棉花“癌症”——黄萎病的病原。该研究通过群体基因组分析，首次阐明了大丽轮枝菌引起棉花等寄主落叶的分子机制，在大丽轮枝菌寄主适应性进化研究方面取得重要进展，将为棉花等经济作物黄萎病病原的分子流行监测预报、抗病品种选育和新型生防药剂研发提供理论依据。

文章题目：《Population Genomics Demystifies the Defoliation Phenotype in the Plant Pathogen Verticillium dahliae》

发表期刊：《New Phytolgist》

研究单位：中国农业科学院农产品加工研究所、华大基因等

影响因子：7.433

发表日期：2019年1月4日

研究背景

大丽轮枝菌是一种通过土壤传播的病原菌，它们能入侵易感植物的木质部维管，从而导致棘手的维管束黄萎病。按照导致宿主完全落叶、部分落叶/不落叶，大丽轮枝菌可被分为落叶型（D）和非落叶型（ND）两种。落叶型病原菌同通常能更快地导致宿主植株死亡，且对宿主的侵染也更加严重，最终导致农作物产量损失。

比较基因组分析表明，转录水平的调控基因以及谱系特异区域编码的铁/油脂代谢物，在大丽轮植菌的宿主适应性中起到了很重要的作用。D和ND病原菌与特定的DNA序列密切相关，落叶型大丽轮枝菌的Vd991菌株的谱系特异区域（G-LSR2）上就编码了7个毒力因子。并且G-LSR2区域内的一些基因产物与一些能导致菌株毒力和宿主适应性的氧化还原反应的相关蛋白质有着同源性。

通过这个研究，研究人员希望实现：

1. 通过全基因组测序确认谱系特异区域GLSR-2与落叶型病原菌的联系。

2. 研究G-LSR2区域中7个棉花特异的毒力因子的功能，如导致落叶。

3. 研究大丽轮枝菌和假定的G-LSR2的起源基因中落叶基因的演变。

4. 研究G-LSR2基因编码的次级代谢产物在导致落叶过程中的角色。

研究成果

群体分析表明，谱系特异区域G-LSR2仅存在于落叶型的大丽轮枝菌致病菌，并且该种菌致使宿主落叶的功能是G-LSR2区域内的7个基因（VdDf1- VdDf7）赋予的。在这7个致落叶的基因当中，VdDf5 和 VdDf6发挥着决定性的作用，并且经实验表明，这两个基因在大丽轮枝菌侵染棉花的过程中增强了菌的毒力。

通过比较F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的基因与大丽轮枝菌上的落叶基因，研究人员发现了经基因水平转移后两者之间的基因差异；并由该比较推断大丽轮枝菌的致落叶功能经基因水平转移，以及基因突变过后变得更强，同时毒力也变得更强。

通过基因注释，研究人员发现G-LSR2区域内的基因与真菌的次级代谢产物密切相关；通过研究发现G-LSR2上的基因簇参与了NAE 12:0（能导致落叶）的合成，其中VdDf5和VdDf6 是最重要的两个基因。

此外，研究人员还发现，与转接了非致落叶菌VDG78的易感棉花相比，FAHH（降解NAE的酶）的含量在转接了致落叶菌Vd991的易感棉花内明显上调；于是推断次级代谢基因簇VdDfs，促进了NAE的有效的生物合成，并将它们转运至植物细胞内。植物体在高浓度的NAE下作出反应，进而上调了FAAH的浓度。

1. 群体基因组分析揭示了谱系特异区域G-LSR2仅存在于大丽轮枝菌的落叶型菌株

方法：利用全基因组重测序研究G-LSR2与落叶型病原菌的联系。

实验材料：受侵染的棉花上收集到的大丽轮枝菌75个菌株。

发现：59个致落叶的菌株能够与22个G-LSR2的基因比对上，16个非致落叶的菌株与G-LSR2上的基因则不能很好地比对上。并且比对上的基因的覆盖度以及深度都很高。

结论：G-LSR2是仅存在于棉花上的致落叶大丽轮枝菌的谱系特异区域。

图1 只有落叶型的菌株能比对上G-LSR2的基因，非落叶型在该区域内的基因缺失。

2. G-LSR2区域里的七个基因导致了大丽轮枝菌的致落叶功能

方法：观察、测量敲除VdDfs基因后的维管束褪色情况以及宿主植物体内生物量的水平。

实验材料：敲除VdDfs基因后的菌株和野生型菌株Vd991，正常棉花植株。

发现：敲除VdDfs基因后的菌株有明显更少的生物量，转接了∆Dfs的植株的维管束褪色情况也更加不明显。

结论：VdDfs基因导致了大丽轮枝菌的致落叶功能。

图2 敲除VdDfs后宿主植株恢复正常不落叶表型，真菌生物量也大大减少

3. 谱系特异区域G-LSR2里的VdDf5 和 VdDf6基因导致落叶表型

方法：从VdDfs的表达分析中得知VdDf5和VdDf6的基因表达量在转接后明显增多，于是本研究验证了它们在所有VdDfs基因中的主导地位。本实验用同时敲除掉VdDf5和VdDf6的菌株，对比同时敲除后恢复VdDf5和VdDf6的菌株对宿主的影响情况。

实验材料：正常棉花植株，双敲除菌株（∆Df5_6-1 and ∆Df5_6-2），恢复了VdDf5和VdDf6的菌株（VdDf5_6）。

发现：双敲除后的菌株不能导致棉花落叶，而重新恢复了VdDf5和VdDf6的菌株重新具有了致落叶功能。

结论：谱系特异区域G-LSR2上的VdDf5和VdDf6导致了落叶型表型。

图3 对每个基因单独敲除，发现VdDf5和VdDf6恢复不落叶表型、生物量明显下降。进一步对VdDf5和VdDf6进行双敲除，实验表明VdDf5和VdDf6敲除后宿主植株不再落叶，生物量下降。恢复两个基因之后又重新获得落叶表型，生物量再次上升。

4. F. oxysporum f. sp. Vasinfectum的基因序列与由F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的基因序列演变而来的落叶基因VdDf5 和 VdDf6的序列之间的差异

方法：为了研究VdDf5和VdDf6在不同遗传背景下的致落叶情况。此研究在不导致落叶的菌株VDG78（收集于棉花）以及VdLs.17（收集于生菜）上构建了能同时表达VdDf5和VdDf6的异位突变体，来研究它们是否能改变不致落叶型菌株的致落叶功能。另外此研究还比对了G-LSR2上的VdDfs序列和其可能的来源F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的VdDfs的同源序列。最后，本实验还探索了F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的VdDfs5和VdDfs5的同源基因Df5_6FO的功能。

实验材料：F. oxysporum f. sp. Vasinfectum的五个菌株，不致落叶型菌株（VDG78）。

发现：VdDf5和VdDf6能够致使非致落叶型菌株（棉花与生菜作为宿主）获得致落叶功能。VdDfs与其在F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的同源区域相比存在着一些基因的突变。F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的VdDfs5和VdDfs5的同源基因Df5_6FO不能够致使非致落叶型的菌株获得致落叶功能，说明V. dahliae上的VdDf5和VdDf6的致落叶功能是由遗传突变产生的，这一突变使得它们具有更高的毒力和致落叶功能。

结论：VdDf5和VdDf6来源于F. oxysporum f. sp. Vasinfectum并且它们的毒力由于基因的突变变得更强。

图4 通过基因组比对发现V. dahliae上的VdDfs与F. oxysporum f. sp. Vasinfectum上的基因具有同源性。D型菌株的NAE 12:0 水平明显高于ND型，敲除了VdDfs的菌株的NAE水平明显下降，但是通过补充VdDf5和VdDf6，菌株的NAE12:0水平增加且高于野生型菌株的NAE12:0水平。

5. G-LSR2是能调控具有催化落叶的化合物的合成的次级代谢产物基因簇

方法：

（1）通过基因注释，预测了G-LSR2上的VdDfs的7个基因的功能。

（2）采集了ΔDfs和野生型菌株的次级代谢产物并将它们使用在棉花苗上，然后还将恢复了VdDf5和VdDf6的ΔDfs菌株的次级代谢产物使用棉花上，由此观察这些代谢产物以及VdDf5和VdDf6的功能。

（3）测量了ND菌株和D菌株的NAE（12:0）水平。

（4）测量了分别转接了D型菌株（Vd991）和ND型菌株（VDG78）的易感棉花内的编码FAAH的基因表达量（RT-qPCR）以及FAAH的含量。

实验材料：易感棉花植株，D型菌株（Vd991）和ND型菌株（VDG78）。

发现：

（1）G-LSR2上的VdDfs的7个基因均与次级代谢有关。

（2）被野生型产生的次级代谢产物以及恢复了VdDf5和VdDf6的ΔDfs菌株的次级代谢产物处理过的棉花苗均表现落叶型。被ΔDfs的次级代谢产物处理过的则没有表现出落叶型。

（3）ND菌株的NAE水平明显低于D菌株。

（4）转接了D型菌株（Vd991）的易感棉花内的编码FAAH的基因的表达量（RT-qPCR）以及FAAH的含量明显高于转接了ND型菌株（VDG78）的易感棉花内的编码FAAH的基因的表达量（RT-qPCR）以及FAAH的含量。

结论：G-LSR2是能调控具有催化落叶的化合物的合成的次级代谢产物基因簇，并且其中VdDf5、VdDf6、VdDf7涉及到了落叶相关的化合物HAE的合成（VdDf5、VdDf6至关重要）。为了应对病原菌V. dahliae产生并运输到植物体内的高浓度的NEA 12:0，植物体会增加NAAH的合成从而降低NEA 12:0的水平。

图5 D型菌株的宿主植株内的编码FAHH的基因的表达水平显著高于ND型菌株以及空白对照组。

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