“三多”lncRNA有这3条经典分析思路

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华大科技一年一度的春季培训开启全新模式 ——1小时线上课堂，专注解惑，在线回复，更接受量身定制，让老师们疫情防控、课题研究两不误！2月25日晚，华大科技技术支持工程师余佳临老师带来《1小时从数据到文章-lncRNA测序数据解析》，以下是课程精华，供大家参考。

lncRNA，科研人称“大三多”——数量多、类型多、连作用模式都非常多的大RNA，是非编码RNA中的明星之一。官方定义长度大于200bp且不具备编码能力的非编码RNA，统称为long non-coding RNA。严格且干脆的描述方式立刻将lncRNA与其他非编码RNA，如miRNA等兄弟姐妹区分开。

数量多

2007年，FANTOM (Functional Annotation of Mammalian cDNA)项目从1000个基因座中检测到近35000个lncRNA，这些RNA与普通的编码mRNA一样，同样包含完整的5'-capping，可变剪接后的外显子内含子组合以及标准的3'-tailing结构。自此，科研人员们逐渐意识到这类RNA的特殊性和复杂性。据不完全统计和估算，lncRNA中不包含多聚腺苷酸结尾的lncRNA大概占40%，总lncRNA可能是mRNA的4~9倍。2018年，GENCODE对人样本的分析和lncRNA的预测发现，人样本中一共检测到270,044个lncRNA。随着lncRNA编码能力预测软件的开发与更新，越来越多神秘的lncRNA正在浮出水面。

类型多

除了对编码能力进行检测，科研人员还会对lncRNA的来源进行界定，一般分为5种：Intergenic、Intronic、Sense、Antisense、Bidirectional。不同来源的lncRNA也有不同的功能，比如Antisense的lncRNA可能会影响其基因组位置上编码的mRNA发生可变剪接。这些lncRNA虽然整体保守性不如mRNA，但它们的核心区域和启动子等元件还是相对保守的，这使得lncRNA在快速适应环境的同时，能有效表达并找到自己的作用目标。

Latgé G, Poulet C, Bours V, Josse C, Jerusalem G. Natural Antisense Transcripts: Molecular Mechanisms and Implications in Breast Cancers. Int J Mol Sci. 2018;19(1):123. Published 2018 Jan 2. doi:10.3390/ijms19010123

作用模式多

不编码蛋白的lncRNA功能主要体现在“调（调）戏（控）”其他基因，“撩妹”技能可谓爆棚，既可以与蛋白质产生相互作用，又可以和DNA反向互补，甚至能直接与各类RNA结合，可谓是中心法则中全过程的参与者，存在感超强。

学者们习惯把lncRNA分成以下8大作用模式。

关于lncRNA参与蛋白修饰或者介导染色质重构的现象，大家可能比较陌生。上文说到，lncRNA可与蛋白质结合发挥作用。它们通过招募染色质重构和修饰复合物到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达。很多DNA/RNA甲基化突变与癌症等某些疾病发生有关，而染色质修饰状态的改变也通常会影响到某些基因的表达状态，最常见的是在启动子区域出现的H3K4me3、H3K9me2及H3K27me3修饰等，这些组蛋白修饰会改变染色质活性，从而促进或抑制转录，控制基因表达。

这类lncRNA中，最典型的是HOXC基因簇转录的lncRNA HOTAIR，它募集染色质修饰复合体PRC2（Polycomb-group proteins，一类使基因发生表观遗传的染色质重塑蛋白，是控制动物组织发育的重要因子），并将其定位到HOXD基因簇位点，改变该区域的染色质修饰状态，进而抑制HOXD基因表达。已有临床研究表明，在乳腺癌、结肠癌和肝癌等肿瘤组织中，HOTAIR表达水平与肿瘤转移、复发及预后效果紧密相关。肿瘤细胞中HOTAIR高表达会抑制某些肿瘤转移抑制基因，促进肿瘤恶化；反之，沉默HOTAIR则会使肿瘤细胞丧失转移能力。除了HOTAIR，还有其他一些lncRNA可以通过募集，对DNA/RNA和组蛋白的表观遗传状态进行修饰，如Xist、Air等。

如图，lncRNA就拉上了PRC2，精准定位到编码基因上游，招募PRC2介导H3K27me3修饰（组蛋白 H3 上的 K9 和 K27 的三甲基化，是一种基因表达的抑制信号）和基因表达。

据统计，人体有超过20%的lncRNA均能形成多硫抑制物复合体。而小鼠胚胎干细胞中表达的lncRNA中，有30%能与至少1条染色质形成复合体。

lncRNA到底如何分析？

1. 最经典的思路，找lncRNA靶作用的mRNA，看看这些mRNA与表型之间的关系。

结合归老师转录组方向的课程，我们不难知道，mRNA的表达和序列发生变化，是会影响编码蛋白的功能的。也就是说，如果lncRNA与mRNA抱团，那么lncRNA就间接影响了这些mRNA。所以，常见的文章中，除了统计lncRNA数目、长度、外显子个数以及种类，最重要的就是分析lncRNA靶作用的mRNA了。

常见的lncRNA与mRNA的作用方式，一般分成两类：cis和trans。其中cis是指lncRNA与mRNA有一定的位置关系，如上下游一定范围内，它们以近水楼台的方式影响附近的mRNA；而trans是指那些没有先天位置优势，但仍然锲而不舍想要发挥作用的lncRNA了。它们千里迢迢游荡到目标mRNA身边后，通过稳定的反向互补结构，结合上lncRNA（一般会通过RNAplex软件进行预测，并计算二者结合的自由能）。

如图，经典的分析中，会提供二者的表达水平是正相关还是负相关、这些mRNA的功能是什么等，来间接完成生物学故事推断。

ChenJ, Zhang C, Zhang N, Liu G. Porcine endemic diarrhea virus infection regulateslong noncoding RNA expression. Virology.2019;527:89–97. doi:10.1016/j.virol.

2. 既然lncRNA还可以与其他RNA结合，那会有全转录组的调控关系吗？

不错，在非编码行列中，有一类短小精悍的miRNA，它们长度只有18-30nt，但却能与mRNA结合，通常还起到抑制mRNA的作用。不凑巧的是明星三多lncRNA也能与miRNA结合。那如果lncRNA把自己奉献出来，给miRNA当活靶子，mRNA不就被解放了吗？这，就是传说中的ceRNA关系，即内源性竞争RNA。常见的全转录组调控关系，通常涉及lncRNA/mRNA/circRNA/miRNA，其中前三类RNA的成员身上均发现过miRNA的应答元件，可与miRNA相结合。

因此，常见的分析角度可总结为：1）纯lncRNA靶向mRNA的分析；2）miRNA加入混战的ceRNA分析；3）各类RNA的共表达co-expression分析。这些，在Dr.Tom系统中均可通过“关联转换”一键点击实现数据抓取，并利用关联网络/关联聚类直接出图。

3. lncRNA可以与蛋白质结合，那就意味着可以做靶向蛋白预测？

是的，结合lncRNA与蛋白的分析预测，找到lncRNA潜在的结合蛋白，注释蛋白功能，如果这类蛋白与表观调控因子，如转录因子、染色质重构蛋白、转录因子辅因子等有作用，甚至可以配合上WGBS（全基因组甲基化测序）、ATAC-seq（全基因组染色质开放性测序）、ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序），捕获受lncRNA影响的甲基化区域、组蛋白修饰等，来个多组学关联，完成生物调控的完整重现。实际很多研究也表明，DNA的甲基化与肿瘤之间有莫大关联，表观调控的作用甚至一定程度上超越了遗传变异。

围绕这三块，进行数据分析，相信您一定能出好文章！

3月课表

进入3月，华大科技春季培训依然如火如荼，明天（3月3日，周二）晚上，《10x单细胞RNA测序数据解析》将如期举行。以下课表收好了，不要错过干货满满的直播——

（以上课表仅供参考，以实际为准）

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