复发率近50%，首次利用蛋白质组学预测药物靶点！
IgG4-RD（Immunoglobulin G4-related disease，免疫球蛋白G4相关疾病）是近年来常见的一种全身性免疫介导性疾病，会影响患者多个器官。临床特征包括血清IgG4水平升高、多器官累及、IgG4+浆细胞密集浸润、明显的组织浸润等，男性比女性更易患病。虽然大多数患者对类固醇治疗的反应良好，但复发率接近50%。目前，关于IgG4-RD的发病分子机制及适当的治疗策略仍有待深入研究。
从蛋白质入手进行疾病研究，是当前研究疾病机理、早期诊断、预后评估和监测疾病发展等的重要手段，而IgG4-RD的蛋白质组研究仍处于空白状态。日前，华中科技大学同济医学院附属同济医院董凌莉教授团队采用iTRAQ技术，首次对IgG4-RD蛋白质组进行了高通量定量检测，同时联合公共数据库中的转录组数据进行分析，为阐明疾病的致病机制、发现药物治疗靶点提供重要的理论依据。相关研究成果“Multiple Processes May Involve in the IgG4-RD Pathogenesis: An Integrative Study via Proteomic and Transcriptomic Analysis”于2020年8月20日发表在 Front. Immunol 上。
研究思路
选择8例初治IgG4-RD患者和8例健康志愿者的血清样本，以及2例IgG4-RD患者和2例非IgG4-RD患者的组织样本，采用iTRAQ蛋白定量技术筛选差异表达蛋白并进行功能注释。同时，下载已发表的组织样品和PBMC样品的转录组数据，采用WGCNA（加权基因共表达网络分析）寻找和IgG4-RD高度相关的转录本。最后，联合蛋白组和转录组数据，阐明疾病发病机理和药物治疗靶点（图1）。
图1 文章整体研究思路
关键结果
1）差异蛋白筛选及功能注释
以差异倍数≥1.2且p <0.05筛选显著差异蛋白，组织中共发现980个显著差异蛋白（DEPs），其中542个上调表达、438个下调表达；血清中共94个DEPs，86个上调、8个下调。
对这些DEPs进行功能富集分析，发现组织中上调DEPs主要参与免疫相关细胞激活、黏附、免疫相关通路等（图2A），下调DEPs主要参与细胞连接相关通路（图2B），血清上调DEPs主要参与蛋白质活化级联、血小板活化等（图3）。
图2 IgG4-RD组织样品DEPs功能注释分析
图3 IgG4-RD血清DEPs功能注释分析
2）转录组数据的WGCNA分析
对来源于组织的GSE40568转录组数据进行WGCNA分析，发现934个基因与IgG4-RD显著相关（图4A turquoise模块），而从来源于PBMC的GSE66456数据中发现360个显著相关基因（图4B yellow模块），进一步对这些基因进行功能注释，发现参与IgG4-RD的3个主要生物过程和一些信号通路。
图4 WGCNA获得的模块-特征关系热图
3）蛋白组和转录组数据联合分析揭示致病机制
IgG4-RD组织中DEPs显著富集在T细胞相关信号和B细胞相关免疫通路，同时组织转录组数据中turquoise模块相关基因也富集在B细胞相关免疫通路，此外PBMC中和疾病相关的转录本也富集在系统性红斑狼疮通路中，表明IgG4-RD为抗体介导的自身免疫性疾病。
IgG4-RD组织中DEPs显著富集在EB病毒感染、人免疫缺陷病毒1 感染等感染相关通路，turquoise模块相关基因也与人类乳头瘤病毒感染等感染相关通路相关，表明感染因子和感染相关过程可能在IgG4-RD的发展和进展中发挥重要作用，即潜在感染与感染相关反应可能是IgG4-RD的触发因素。
另外，IgG4-RD组织和血液中DEPs显著富集在血小板激活通路，同时turquoise模块相关基因也显著富集在此通路，表明血小板可能作为免疫成份参与调控过程（图5）。同时还发现很多其他信号通路参与该疾病的发病，包括Rap1信号通路、自噬、凋亡等。
图5 IgG4-RD中存在血小板激活现象
4）基于蛋白组数据筛选潜在药物作用靶点
对top30 KEGG通路和top30 GO生物学过程的蛋白进行网络分析，共筛选出15个hub蛋白（图6），其中很多hub在各种类型的免疫细胞中均是免疫相关信号通路的重要成分。针对这些蛋白的药物可能有助于IgG4-RD的治疗。
图6 top30 KEGG通路和top30 GO生物学过程的蛋白network构建
科技君点评
1）iTRAQ试剂共8个标签，适用于少于8例样品的检测。本案例是首次将蛋白质组学应用在IgG4-RD中的探索性研究，后续势必需要在更大规模的样品中进行检测，这时就要用到DIA蛋白定量技术。DIA蛋白定量技术凭借其质谱信息采集的全面性及稳定性，能有效提高蛋白质及肽段的检测覆盖度及重复性，是目前大规模样本蛋白质组检测的理想手段。
对于临床研究最常见的样品类型血清/血浆，华大基因近期推出了“自建血液样品谱图库”BGI-BPSL（Blood Proteome Spectral Library），省却实际项目再次建库的时间和费用。
2）针对少量样品的前期探索性研究，除iTRAQ外，还可采用10-plex IBT或TMT进行检测。iTRAQ/IBT/TMT均为同重同位素标签，通过与蛋白酶解产品的肽段结合后合并样品上机检测，获得蛋白鉴定和定量信息。对于少量样品研究而言，iTRAQ/IBT/TMT具有更优的稳定性和重复性。
3） 通过iTRAQ/IBT/TMT/DIA等获得的差异表达蛋白，经过与表型、临床等数据结合筛选出所关注的蛋白之后，一般需要进行进一步的验证，通常可以选择基于质谱的MRM/PRM、或基于免疫反应的western blot等，这就是我们常说的蛋白质组学中的发现到验证的研究思路。
4）转录组与蛋白质组都具有时间和空间表达特异性，本案例转录组来源于其他中心发表的数据。后续研究时，可选择同一批样品分别进行转录组和蛋白组检测，之后对两组学数据进行关联，获得基因表达的全景图，更全面地研究疾病发病机制等。
针对上述几点，华大基因可提供不同蛋白定量产品，以及从发现到验证的一站式服务（iTRAQ/IBT/TMT + MRM/PRM、DIA + MRM/PRM），和蛋白组+转录组多组学关联分析服务，满足科研工作者各方面需求！更多产品信息欢迎联络当地销售经理~
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.01795/full
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