教科书式高分范例！如何利用代谢组学寻找biomarker？

寻找疾病的生物标志物（biomarker）是代谢组一直以来应用最为广泛的方向之一。迄今为止，许多疑难病症的早期诊断仍然是一大医学难题，这其中就包括了慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）。目前CP的诊断主要还依赖于患者症状及其影像学特征，这阻碍了临床上对CP的早期诊断和及时治疗。

近日，GUT在线发表了德国格拉夫瓦尔德医学院（University Medicine Greifswald）团队题为“Identification and validation of a multivariable prediction model based on blood plasma and serum metabolomics for the distinction of chronic pancreatitis subjects from non-pancreas disease control subjects”的最新成果，该研究是首个利用队列样本对CP的代谢生物标志进行探究并验证的项目，教科书式地展现了CP血液生物标志物的发现过程。

实验设计

研究将GC-MS及LC-MS/MS结合使用，对样本的代谢组数据进行了采集，并依照TRIPOD模型设计了研究队列（图1）。采用了经典的代谢组学生物标志研究的三步走（发现-验证-确认）的方法：先在Identification Study中通过对比CP患者及非CP患者的代谢数据找到生物标志物，随后在First Validation Study及Second Validation Study中对生物标志物进行了验证和评估。

图1 研究设计，Identification Study及First Validation Study中Control组为非CP患者；Second Validation Study中Control组为健康患者，LC组为肝硬化患者

主要研究成果

1. 代谢组检测结果

研究共检测到1449种代谢物（838已知及611未知化合物），其中血浆样本（Identification Study & First Validation Study）中有505种已知化合物及115种未知化合物，血清样本（Second Validation Study）中有498种已知化合物及118种未知化合物通过数据过滤被选中用于统计分析。

2. PCA分析

通过在无监督模式下对代谢组学数据进行多统计分析（PCA分析），观察发现在Identification Study及First Validation Study中CP及非CP患者存在较大重叠，但能在PC1轴中作出一定区分（图2A）；而在Second Validation Study中CP则可与Control组完全分开（图2B），这可能是由于在Second Validation Study中采用了健康人而不是非CP患者作为Control组。

图2 PCA分析试图

3. 代谢标志物的发现及验证

研究使用朴素贝叶斯算法（Naive Bayes Algorithm）对Identification Study中的数据进行训练和建模，发现了一组由8个代谢物组成的panel（表1）可作为标志物将CP患者及非CP患者进行区分，受试者曲线（ROC）模型则表明这组生物标志物panel能较好地区分CP患者及非CP患者（AUC = 0.85，图3A）。随后标志物panel分别在First Validation Study （AUC = 0.85，图3B）及Second Validation Study（AUC = 0.87，图3C）这两个确认集中进行了验证，有较好的分离效果，且Second Validation Study较好的验证结果也表明该标志物panel同时适用于血浆及血清样本检测。

图3 代谢标志物panel对于CP的预测效果

4. 代谢标志物的多统计分析结果

对预测模型中的8种代谢物进行多统计分析，结果表明这8种代谢物的表达在血浆样本试验的（Identification Study及First Validation Study）CP组中都发生了改变，其中有6种在血清样本试验（Second Validation Study）的CP组中发生了改变。Beta-carotene在预测模型中起着最重要的作用（表1），但一种代谢物仍不足以对CP进行预测，由多种差异代谢物组成的标志物模型具有更好的预测效果。

表1 代谢标志物panel中的8种代谢物及其统计学分析结果

科技君点睛

研究首次基于队列样本的代谢组检测结果对慢性胰腺炎（CP）的诊断标志物作出了预测，为未来临床上CP早期诊断标志物的开发奠定了基础，同时也教科书式地展现了利用代谢组学对生物标志物进行挖掘的过程。

代谢组是基因组的最下游产物，也是最接近于生命体表型的一种组学研究。代谢物通常可以反映出机体对基因突变及环境影响产生的响应，是具有重要潜力的生物标志物库，在医学研究领域有重要的价值。对复杂的生物样本进行研究时，一种差异代谢物可能不足以区分实验组及对照组，多种代谢物组合而成的标志物panel可能具有更好的预测效果，此时可以选取合适的模型结合实验集及验证集对生物标志物进行预测和验证。

华大代谢组学采用 Q Exactive 系列质谱仪进行检测分析，Q Exactive系列质谱仪具有超高分辨率、超高质量精度和极佳的稳定性，能更有效地对样本代谢数据进行平行分析。通过标准品数据库进行代谢物鉴定，能对代谢物结构进行更好的解析。

同时，华大也具有丰富的大样本执行经验，配备有高通量自动化样本制备系统，单日样本制备通量1000+例，结合严格的质控体系，可实现大样本的高质量交付。

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原文链接：

https://gut.bmj.com/content/early/2021/02/18/gutjnl-2020-320723

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