肠道菌群的蛋白酶解如何影响人体疾病？宏蛋白质组研究揭示调控机制

肠道菌群处于动态环境中，受到来自外来药物、饮食、其他微生物和宿主内源性化学成分的蛋白质毒性及代谢压力的影响。蛋白酶解调控能通过快速降解错误折叠蛋白和激活调节蛋白，使肠道菌群快速响应肠道环境的动态变化。然而目前相关研究多集中在单一微生物对简单环境刺激的响应，对于复杂疾病状态下肠道菌群蛋白酶解特征的改变尚未有系统报道。

炎症性肠病（IBD）主要由克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）组成，是一种受遗传和环境因素影响的慢性炎症性疾病，有研究证实IBD与肠道菌群失调有关。近日，中山大学附属第五医院研究团队在Microbiome杂志发文，报道了一种以半胰蛋白酶解肽为核心的宏蛋白质组挖掘方法，结合综合的数据库、两步多引擎数据库搜索和高分辨率质谱数据集，首次从公共数据集中分析肠道菌群的蛋白酶解特征。揭示了肠道菌群蛋白酶解调控在IBD中的特异性变化，在菌群结构和蛋白质丰度之外提供了IBD菌群代谢和功能变化信息，可用于宿主-菌群互作的调控机制研究。

研究方案设计

选择两组已发表的健康人和IBD患者宏蛋白质组数据集：

数据集1（PXD008675），由89名年龄6-58岁且中位年龄22.8岁的受试者（24名非IBD对照、39名CD患者和26名UC患者），共447例粪便宏蛋白组数据组成（120例非IBD样本、204名例CD样本、123例UC样本）。其中272个样本有对应的宏基因组数据，184个样本有对应的宏转录组数据。

数据集2（PXD007819），从升结肠（AsC）、降结肠（DeC）和回肠末端（TI）收集的176例黏膜腔界面（MLI）的宏蛋白组数据，来源于71名儿童患者（<18岁，包括24名非IBD对照、25名CD患者和22名UC患者）。

同时分析了一个蛋白质组数据集（PXD000498），以表征热胁迫（42℃和37℃，3次生物学重复）对大肠杆菌K-12蛋白酶解调控的影响。

图1 以半胰蛋白酶解肽为核心的宏蛋白质组挖掘方法

主要研究成果

1. 探索以半胰蛋白酶解肽为核心的宏蛋白质组数据挖掘方法

分析健康人和IBD患者的623个宏蛋白质组数据，揭示IBD肠道菌群蛋白酶解特征。在粪便、AsC、DeC和TI中分别鉴定出7,969 (6.35%)、14,869 (19.48%)、15,128 (14.24%) 和15,360 (16.55%) 个人特异性肽，其中5,104 (64.05%)、5,724 (38.50%)、5,254  (34.73%) 和6,825 (44.43%) 为半胰蛋白酶解肽。

GO分析发现，在粪便、AsC、DeC和TI中，分别有84.13%、79.97%、81.74%和80.18%的人半胰蛋白酶解肽来自胞外蛋白，较高比例的胞外蛋白对肠腔和粘膜蛋白酶更敏感。

2. 半胰蛋白酶解肽的相对丰度和分布

在447个粪便宏蛋白质组中，超过75%的样本发现了20个主要微生物亚群（图2A）、35个主要生物过程（图2B）和32个酶亚类（图2C），半胰蛋白酶解肽的相对丰度（NRASP）分布情况如图2所示。

拟杆菌门和厚壁菌门、拟杆菌门和梭菌门、拟杆菌门和梭菌门、拟杆菌科和拟杆菌属的NRASP中值在1左右，个体差异很小。大多数生物过程NRASP的中位数也在1上下波动，IBD菌群功能变化主要涉及碳水化合物运输和代谢、氧化应激、细胞运动、蛋白质合成和成熟。

图2 447个粪样宏蛋白质组中主要微生物亚群（A）、主要生物过程（B）和酶亚类（C）的半胰蛋白酶解肽的相对丰度的总体分布，左右滑动查看

3.半胰蛋白酶解肽与肠道菌群结构、微生物蛋白酶和分子伴侣、宿主蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白的关联

为了探究半胰蛋白酶解肽模式与肠道菌群群落结构的潜在相关性，将肠道菌群半胰蛋白酶解肽LFQ强度与微生物群落β-多样性进行关联分析（图3A）。

进一步，为研究与微生物蛋白酶的关系，利用微生物蛋白酶/肽酶的转录丰度（图3B）进行关联分析，发现菌群蛋白酶解模式与β多样性相关性较低（图3C），与微生物蛋白酶和分子伴侣有一定关联（图3D），在调节细胞过程中，微生物蛋白酶和分子伴侣都对蛋白质的错误折叠作出反应，并在蛋白质稳态中发挥重要作用。半胰蛋白酶解肽与宿主蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白负相关，可能与宿主因子对肠道菌群酶解抑制作用有关。

图3 肠道菌群蛋白酶解模式、组成和蛋白酶表达的相关性分析

4. 半胰蛋白酶解肽分析揭示菌群蛋白酶解特征

使用NRASP作为蛋白质酶解的指标，发现在粪便(图4)和MLI(图5)的宏蛋白质组中，分类、功能分布和酶切位点motif方面都存在显著的组间差异。

在447例粪便宏蛋白质组中，20个主要分类亚组中有4个组间差异显著 (图4A)，35个主要生物过程中有6个组间差异显著(图4B)，32种主要酶亚类中有4种表现出组间差异(图4C)。粪便宏蛋白质组也揭示了微生物蛋白酶解motif的变化。在层次聚类分析中(图4D)，CD、UC与对照组存在不同的表达特征。然而，在PLS-DA分析（图4E）中，组与组之间没办法较好分离开。

图4 IBD粪便样本中微生物蛋白酶解改变的特征

在AsC宏蛋白组分析中，CD和UC中有关翻译调节、碳水化合物运输、DNA修复、蛋白质分泌、前体代谢产物和能量的产生以及羧酸代谢过程的NRASP显著增加(图5A)。

在DeC宏蛋白组分析中，UC中发生的变化最多，在核糖体生物合成、萜类生物合成过程、UMP生物合成过程、细胞分裂和翻译终止过程中NRASP显著增加；在糖异生过程中NRASP减少(图5B)。

在TI宏蛋白组分析中，CD中发生的变化最多，在碳水化合物转运过程中NRASP增加，翻译终止、ATP合成偶联质子转运以及转录、翻译、蛋白质折叠、碳水化合物代谢过程中NRASP减少(图5C)。

IBD菌群蛋白酶解特征的改变主要发生在TI处和DeC处。

图5 基于标准化半胰蛋白酶肽相对丰度的IBD蛋白酶解改变的特征

综上，蛋白酶调控是肠道菌群适应肠道环境变化的重要方式，IBD患者的菌群蛋白酶调控变化主要涉及碳水化合物运输和代谢、氧化应激、细胞运动、蛋白质合成和成熟。通过宏蛋白组研究揭示了IBD患者菌群蛋白酶调控改变主要发生在TI和DeC，这与IBD的临床病灶位置完全一致，显示了该方法的准确性及其在微生物介导的发病机制研究中的巨大潜力。以半胰蛋白酶解肽为核心的宏蛋白组方法可以更好地研究肠道菌群和宿主微生物相互作用，更好地解释其酶解特征，更深层次挖掘调控机制。

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原文链接：

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-00967-x

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