单细胞制备经验大放送！“身体第一守护者”——皮肤，CNS都在做

继上周干货文章——《单细胞技巧大公开！藏得很深的主动脉夹层，还在纠结如何解离吗？》发布后，受到老师们的一致好评~ 科技君趁热打铁，再为大家带来一篇皮肤解离必备文章，持续助力单细胞测序！

皮肤由表皮和真皮组成。外层的表皮主要包括角质形成细胞、抗紫外线黑色素细胞和朗格汉斯细胞，作为抵御外部环境的物理屏障，介导外来病原体的免疫识别^[1,2]。内层的真皮主要由复杂的细胞外基质、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞组成，并含有丰富的毛细血管、淋巴管、神经末梢等，为皮肤提供强度弹性、营养和传导知觉^[3,4]。

皮肤是人体最大的器官和第一道生理防线，时刻维持着机体的各项功能活动如：屏蔽紫外线（UV）辐射和传染性病原体、感知温度压力、调节体温、分泌和存储营养物质等^[5,6]。当皮肤发生病变，将可能引发皮肤相关疾病如湿疹、银屑病等炎症性疾病，白癜风等免疫性疾病，鳞状细胞癌等皮肤肿瘤。皮肤疾病种类繁多，病因复杂且病理不清，可通过单细胞测序揭示细胞异质性，描述疾病的动态发展过程，现已应用于研究皮肤疾病、皮肤发育再生和衰老等多个领域。

科学研究中常选用健康皮肤和病变皮肤作为材料，研究皮肤相关疾病的机理；或选取不同年龄段的健康皮肤，用于探索衰老机制等。华大科技现可以实现皮肤组织的成功解离，科技君在这里跟大家毫无保留地分享我们的解离经验，帮助大家在皮肤研究领域开荒拓土，深入挖掘皮肤病变背后的机理。

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解离前相关物料准备

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实验步骤

1）按照如下配方配制酶溶液：将Collagenase Ⅰ、Collagenase IV、Dispase溶于不加FBS的培养基中，至终浓度分别为1mg/mL，置于37℃水浴锅中预热；

2）将干净组织块用手术刀剪碎至1-2mm²大小，转移至含有酶解液的15mL离心管中，37℃水浴锅中消化；

3）每30min用枪吹打数次，通过台盼蓝染色镜检观察组织消化状态，直至无明显组织块后停止消化；

4）使用40μm细胞筛过滤细胞悬液（细胞筛需用预冷PBS提前润洗），用预冷2~3mL完全培养基清洗残留细胞并过滤清洗液，收集滤液至15mL离心管中；

5）4℃离心，弃去上清；

6）加入2mL常温红细胞裂解液重悬沉淀，裂红2min，接着加入2mL预冷PBS溶液终止反应；

7）4℃离心，弃去上清（若沉淀仍有明显红色，则再重复步骤6）；

8）加入适量10%FBS培养基重悬沉淀，台盼蓝染色镜检观察结团情况，如结团较多，加入2mL TrypLE消化数分钟，期间镜检观察，若视野内无明显细胞结团，可终止消化；

9）4℃离心，弃去上清；

10）根据细胞沉淀量加入适量预冷完全培养基重悬并混匀沉淀；

11）台盼蓝染色镜检观察细胞悬液中是否有较多死细胞和碎片，若细胞活率较差，则离心后根据说明书用去死细胞试剂盒进行去死细胞操作；

12）加入适量10% FBS培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后计数。

Tips：皮肤组织消化时间较长，若有摇床配合使用，则解离效果更佳；皮肤细胞悬液制备中容易出现结团偏高的情况，可根据结团程度添加TrypLE消化适量时间，降低结团率。

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实验结果

图1 上机前计数结果示意图

图2 细胞计数仪统计结果

梳理完“身体第一守护者”——皮肤的解离技术，科技君总结了四篇高质量的技术应用文章，继续与大家探索，解读单细胞测序技术的奥妙！

案例研究1

差异性成纤维细胞决定皮肤自身免疫模式

文章标题：Anatomically Distinct Fibroblast Subsets Determine Skin Autoimmune Patterns

发表时间：2021年12月

发表期刊：Nature（49.962）

研究设计：对10例白癜风患者和5名正常人的不同部位皮肤样本进行单细胞测序，得到50,000多个细胞

DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04221-8

案例研究2

人皮肤老化的单细胞转录组图谱

文章标题：A Single-Cell Transcriptomic Atlas of Human Skin Aging

发表时间：2021年2月

发表期刊：Developmental Cell（12.27）

研究设计：不同年龄健康人眼睑皮肤的9个样本，分为青年（18~28岁）、中年（35~48岁）、老年（70~76 岁），过滤后共有35,678个细胞，进行高通量scRNA-Seq

DOI：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.11.002

案例研究3

炎症性皮肤病（湿疹和银屑病）的发育起源

文章标题：Developmental cell programs are co-opted in inflammatory skin disease

发表时间：2021年1月

发表期刊：Science（47.728）

研究设计：受孕后7~10周的人胚胎皮肤、乳房整形手术产生的健康成人皮肤剩余以及受湿疹和银屑病（两种常见的炎症性皮肤病）影响的患者的皮肤活检样本，得到超过500,000个细胞进行高通量scRNA-Seq 

DOI：https://doi.org/10.1126/science.aba6500 

案例研究4

单细胞转录组和空间转录组揭示人鳞状细胞癌组成以及空间位置

文章标题：Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma

发表时间：2020年7月

发表期刊：Cell（41.582）

研究设计：10位病人的皮肤鳞状细胞癌及其对应的正常皮肤细胞进行高通量scRNA-Seq和空间转录组分析，共分离出48,164个细胞用于高通量scRNA-Seq

DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.039

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科技君点睛

高质量的单细胞悬液是单细胞测序成功的关键一环。由于各种组织类型胞间组成差异较大，制备悬液的方法也不尽相同，需要大量不同组织的解离经验加成，才能保证对各种组织解离起来得心应手。而华大科技在单细胞悬液制备上积累了多年经验，目前已完成人、鼠、家禽类和水产类等累计50+物种、300+种组织类型、5,000+份样本的成功解离，解离效果受到客户们的赞扬与支持。

悬液制备成功率与样本保存方式也有一定关系，优先推荐各位老师通过组织保存液寄送新鲜组织，可以较好地保留细胞活性。

科研路上，华大科技与您一路同行！

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参考文献：

[1] McGrath, J.A.; Eady, R.A.; Pope, F.M. Rook's Textbook of Dermatology 7th. Blackwell Publishing. 2004: 3.1–3.6. ISBN 978-0-632-06429-8.

[2] The Ageing Skin–Structure. pharmaxchange.info.March 3, 2011

[3] Breitkreutz, D; Mirancea, N; Nischt, R. Basement membranes in skin: Unique matrix structures with diverse functions?. Histochemistry and cell biology. 2009, 132 (1): 1–10. PMID 19333614. doi:10.1007/s00418-009-0586-0.

[4] Smith MM, Melrose J. Proteoglycans in normal and healing skin. Adv. Wound Care. 2015, 4 (3): 152–73. PMID 25785238. doi:10.1089/wound.2013.0464.

[5] Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. (2008). The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17(12):1063–72. PMID 19043850

[6] Madison KC. (2003). Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. J Invest Dermatol. 121(2):231-41. doi:10.1046/j.1523-1747.2003.12359.x PMID 12880413

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