揭开新冠神秘的面纱 | RNA测序文章集锦

 ● RNA测序在新冠研究中有哪些应用？ ● 

2022 BGITech

RNA测序因应用广泛，价格门槛又低，一直以来都是科研小伙伴做测序的入手经典款，也因此每年RNA测序的文章颇多。所以科技君分成不同热点应用方向，整理了多个RNA测序文章集锦，希望对您的科研设计和文章发表有所裨益。今天我们就来聊聊第一个研究方向——新冠。

自从新冠疫情爆发以后，全球各地的科研人员不懈努力，以破解新冠病毒的结构序列、寻找新冠肺炎治疗药物、研发新冠疫苗等，对于全球范围内的新冠疫情防控，以及对其他病毒的研究，都有巨大的积极作用。其中就有多项研究利用RNA测序，从表达调控层面揭开新冠神秘的面纱，让我们一起来看看：

案例一

绘制新型冠状病毒SARS-CoV-2的转录组结构图^[1]

文章题目：The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome.

发表期刊：Cell

影响因子：41.582

发表单位：韩国基础科学研究院、韩国首尔大学和韩国疾病预防控制中心

研究概述：研究人员绘制了SARS-CoV-2病毒的转录组结构图，该病毒与COVID-19大流行有关。这项研究中还发现了许多新的病毒RNA和这些病毒RNA上存在的多种未知的化学修饰。这些成果将有助于了解这种病毒如何复制以及它如何逃避人类防御系统的监视。其中利用DNBSEQ真核链特异性转录组测序技术，绘制新型冠状病毒SARS-CoV-2的转录组结构图。

测序设计：样品为SARS-CoV-2感染的Vero细胞。DNBSEQ真核链特异性转录组，PE100测序。

研究成果：利用DNBSEQ测序，研究人员验证了sgRNAs及其连接位点，测得了305,065,029reads，平均插入长度为220nt（图1C），结果与纳米孔RNA测序（DRS）数据基本一致，leader-body junction被频繁地测序到，在覆盖度图中的5’端产生一个尖峰（图1D），3’末端如预期一样显示了嵌套转录本的高覆盖度。

图1 DNBSEQ测序数据统计（Read counts和基因组覆盖度）

利用DNBSEQ的深度测序，研究者确认和检查CoV基因组的junctions，绘制了junctions 5’和3’断点，并估计融合频率（图2A）。SARS CoV-2使用典型的TRS介导的模板转换机制进行不连续转录，以产生主要的sgRNA（图2B）。N RNA是表达最丰富的转录本，其次是S，7a，3a，8，M，E，6和7b（图2C）。

图2 DNBSEQ测序数据分析得到的病毒亚基因组RNA及其重组位点

亮点：这篇文章是研究病毒本身，对病毒进行测序，数据显示，DNBSEQ测序具有可以高精确地分析大量序列的优势。

案例二

4-OI和DMF对SARS-CoV2等病毒具有抗病毒和抗炎活性作用^[2]

文章题目：SARS-CoV2-mediated suppression of NRF2-signaling reveals potent antiviral and anti-inflammatory activity of 4-octyl-itaconate and dimethyl fumarate.

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

发表单位：丹麦奥尔胡斯大学、丹麦奥胡斯大学医院等

研究概述：研究人员发现NRF2激动剂4-辛基衣康酸（4-OI）和富马酸二甲酯（DMF），能有效抑制引起COVID-19的冠状病毒复制，同时还能有效抑制因感染病毒引发的炎症反应。

测序设计：样品为人类角质细胞系HaCaT细胞，HSV感染+4-OI处理，HSV感染（无4-OI处理），4-OI处理（无HSV感染）以及无处理的对照。DNBSEQ真核链特异性转录组，PE100测序。

研究成果：研究团队通过公开的COVID-19患者的肺部组织转录组数据，鉴定出与COVID-19高度相关的炎症和抗病毒通路，也发现NRF2依赖的抗氧化应答基因表达则相应下调。通过体外实验证实了SARS-CoV-2感染明显抑制了NRF2诱导的下游基因表达。

图3 在GEO数据库中COVID-19患者活检数据中NRF2驱动基因的表达受到抑制

4-OI的抗病毒作用还扩展到其他人类致病病毒。利用人类角质细胞系HaCaT，4-OI也抑制了HSV1和HSV2的繁殖。研究人员在IFNAR、STAT1敲除细胞进行了病毒感染实验，4-OI依然能够抑制病毒的增殖，证实了4-OI的抗病毒活性独立于干扰素通路。

图4 4-OI广泛抑制其他致病病毒，包括HSV、VACV和寨卡病毒

亮点：这篇是研究如何治疗新冠病毒，借助公开的COVID-19患者转录组数据，挖掘出具有抗病毒和抗炎活性作用关键因素，然后利用DNBSEQ转录组测序扩展到其他人类致病病毒。

案例三

宿主miRNA-223-3p对SARS-CoV诱导的肺部炎症病理学作用^[3]

文章题目：Contribution of Host miRNA-223-3p to SARS-CoV-Induced Lung Inflammatory Pathology.

发表期刊：American Society for Microbiology

影响因子：7.867

发表单位：西班牙马德里国家生物技术中心（CNB-CSIC）分子和细胞生物学系、计算基因组学服务

研究概述：研究人员发现miRNA-223-3p通过靶向参与肺部炎症的不同宿主mRNA参与了SARS-CoV感染过程中E蛋白介导的炎症反应，并提示miRNA-223可作为为SARS-CoV感染的潜在治疗靶点。

测序设计：从未感染（n=4个生物学重复）、感染强毒性SARS-CoV-WT（n=3个生物学重复）、感染减毒SARS-CoV-ΔE的BALB/c小鼠肺部组织提取小RNA及大RNA，进行Small RNA SE50测序，测序数据量20-40M reads，以及长链非编码RNA测序，测序数据量20M reads。

研究成果：本研究通过研究感染了强毒性SARS-CoV-WT或不含E蛋白基因的减毒突变体（SARS-CoV-ΔE）的小鼠肺中宿主miRNAs的差异表达，探讨miRNAs在SARS-CoV发病中的相关性。利用小RNA测序（RNAseq）鉴定到在SARS-CoV强毒和弱毒感染中差异表达的23个miRNA，表明差异表达的miRNA可能有助于调节宿主对E蛋白诱导的强毒性SARS-CoV感染的肺部炎症反应。结合长链非编码测序数据，通过对miRNA及其相关靶mRNA的功能富集分析发现，参与细胞因子介导的炎症调节的miRNA-145a-IRS1和miRNA-223-MEF2c在强毒性感染中成表达负相关。并进一步利用qPCR验证miR-223-3p和miR-145a-5p模拟物对SARS-CoV感染期间人肺Calu-32B4细胞炎症通路的影响，结果发现，在感染SARS-CoV-WT（48和72h）或SARS-CoV-ΔE（72h）后，转染miRNA-223-3p模拟物后促炎趋化因子CXCL10mRNA表达显著上调，表明在该细胞系中，miRNA-223-3p调节了促炎反应。

图5 感染强毒性 SARS-CoV-WT、减毒 SARS-CoV-ΔE的小鼠肺中microRNA的差异表达

研究人员进一步利用小鼠体内感染miRNA抑制实验探究miR-223-3p抑制对SARS-CoV感染小鼠的影响，结果表明，使用反义锁核酸（LNA）体内抑制miRNA-223-3p可减少肺泡水肿。

图6 miRNA-223-3p抑制对SARS-CoV感染小鼠肺组织病理学的影响

由于miRNA-223抑制，NLRP3炎症小体和促炎趋化因子CXCL10、CXCL2和IL-1ß的mRNA表达水平增加，表明miR-223-3p在体内有助于抑制SARS-CoV感染诱导的过度肺部炎症。

miRNA-223抑制还增加了离子转运蛋白囊性纤维化跨膜调节剂（CFTR）的表达，该调节剂参与了肺泡水肿的消退，但这在感染了强毒小鼠的肺部显着降低，这提示miRNA-223在体内不仅可通过影响促炎细胞因子和趋化因子的表达，还可通过影响水肿缓解相关的细胞因子参与体内SARS-CoV引起的肺部炎症的调节。

亮点：本篇文章通过长脸非编码RNA测序及Small RNA测序数据探究了SARS-CoV诱导的炎症反应过程中发生的mRNA-miRNA 相互作用的复杂和动态网络，首次探究miRNA-223-3p在E蛋白介导的SARS-CoV强毒性感染炎症反应调节中的体内相关性，并揭示miRNA在SARS-CoV感染过程中具有治疗潜力。

图7 miRNA-223参与E蛋白介导的SARS-CoV感染发病机制的作用靶点概览

● 科技君点睛 ● 

1、前两篇真核转录组文章，采用的是DNBSEQ链特异性转录组，那华大的DNBSEQ真核链特异性转录组产品有何优势呢？

（1）DNBSEQ链特异性建库方法，数据质量高，技术重复性好，与qPCR相关性高；

（2）DNBSEQ测序平台，测序准确性高，无Index hopping之忧，低Dup rate，CNS顶级期刊发表过超千篇转录组文章；

（3）Dr. Tom系统，获得多组学关联信息，多数据库联合分析，多维度数据展示，循环挖掘数据，轻松自主做个性化分析。

2、第三篇采用Small RNA测序及长链非编码RNA测序，华大的DNBSEQ全转录组高通量测序，采用去核糖体链特异性建库方法和小片段富集筛选建库方法，可实现编码RNA和非编码RNA的建库、测序、信息分析及联合分析、ceRNA等，从而快速全面准确地获得与特定生物学过程（例如发育、疾病等）所有大、小RNA转录本数据信息，这一项研究将调控机制研究延伸到“网、多层面”结合的立体模式，有助于相对全面解读生物学现象，产品优势：

（1）实验严谨：建库工艺稳定，技术重复性高，可接受多种类型样本，total RNA最低起始量低至400ng；

（2）分析全面：包含RNA互作模式，及ceRNA竞争网络分析等，从平面调控研究延伸至立体调控研究；

（3）数据交互：采用Dr.Tom多组学数据挖掘系统，10大数据库注释，多维度结果图片展示，数据图表循环挖掘；

3、RNA全线产品已升级最新版KEGG数据库，Small RNA和环状RNA等产品信息分析已全新升级。

参考文献：

[1] Kim D, Lee J Y, Yang J S, et al. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome[J]. Cell, 2020, 181(4): 914-921. e10. 

[2] Olagnier D, Farahani E, Thyrsted J, et al. SARS-CoV2-mediated suppression of NRF2-signaling reveals potent antiviral and anti-inflammatory activity of 4-octyl-itaconate and dimethyl fumarate[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-12.

[3] Morales L, Oliveros J C, Enjuanes L, et al. Contribution of Host miRNA-223-3p to SARS-CoV-Induced Lung Inflammatory Pathology[J]. Mbio, 2022, 13(2): e03135-21.

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