干货收藏！4位大咖倾囊相授疾病单细胞研究热点与方案

单细胞测序技术在近年来蓬勃发展，其中华大高通量单细胞DNBelab C系列平台作为后起之秀，以其高性价比优势，已成功助力多篇疾病领域的高分研究成果发表^[1-3]。

疾病研究专题

为加强学术交流，拓展国产自主平台单细胞测序应用，共同推动测序领域的创新与发展，9月28日（周三）14:00-17:00，深圳华大基因科技服务有限公司联合深圳华大生命科学研究院、深圳华大智造科技股份有限公司，顺利举办了“DNBelab C系列单细胞应用线上研讨会之疾病研究专题”，特邀四位单细胞领域专家学者凝聚多年一线行业经验，与您一起探讨疾病的单细胞前沿热点研究和分析方案等，启发疾病领域的单细胞研究创新思路。

没能亲临研讨会现场的老师们也别遗憾，科技君为您整理了研讨会回顾和精华总结，扫描下方二维码即可观看回放！

报告一

单细胞测序技术在免疫疾病研究中的应用

► 专家简介 

► 授课内容 

本次研讨会，殷建华老师首先对免疫疾病单细胞研究做了背景介绍：免疫疾病的特征与单细胞测序技术在解析免疫组织异质性上的显著优势。接着，殷建华老师具体说明了单细胞测序在免疫疾病研究中的分析功能，如鉴定关键细胞类群和关键基因的分子特征和功能变化，系统解析免疫功能的状态等。接下来根据具体案例介绍了经典疾病单细胞研究的思路^[4-5]：选取健康和疾病组，分别测序后，对比两组的细胞类型变化，找到疾病特异性相关细胞类型；再通过差异表达分析鉴定疾病相关分子特征，以及互作网络等。然后殷老师回顾了早期有代表性的免疫疾病单细胞研究成果：取11个健康组和33个病例组的外周血，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），进行单细胞转录组测序，研究系统性红斑狼疮^[6]；分析显示相对于健康对照组，干扰素信号通路在多个细胞亚群中都存在高表达。另一个研究选12个健康组和18个对照组，构建了肠炎的免疫单细胞图谱，找到疾病中扩增的免疫细胞类群，未来可靶向这类细胞开发药物^[7]。

殷建华老师还基于多个案例介绍了单细胞测序在免疫疾病中的未来发展趋势：单细胞作为基础筛选和发现工具（关键基因/药物靶点）^[8-10]，结合WGS（Whole Genome Sequencing，全基因组测序）找到关键基因库，靶向敲除后深入研究基因功能的作用机制；基于单细胞测序的免疫表型临床检测；大样本临床队列研究^[11-12]；免疫疾病的单细胞eQTL（expression quantitative trait Loci，表达数量性状基因座）研究^[13-15]，并整理推荐了一种研究方案。

► 研讨会点睛 

1. 单细胞测序在免疫疾病上的分析功能

2. 基于单细胞测序的免疫表型临床检测

3. 单细胞大人群eQTL研究的推荐方案设计

报告二

单细胞转录组揭示新冠肺炎感染和疫苗接种引起的免疫响应

► 专家简介 

► 授课内容 

本次研讨会，赵迎泽老师带大家探讨了单细胞技术研究新冠肺炎与流感病毒感染机体后引起的免疫应答差异^[17]。该研究共招募了5名新冠肺炎患者，其中1名重症感染者，2名流感急性期患者，3名健康人群，收集PBMC进行单细胞转录组测序。聚类和细胞注释后，分析不同样本中细胞类型的比例变化，发现在病毒感染患者中，浆细胞和循环浆细胞比例显著增加。进一步分析发现I型干扰素应答和病毒防御信号应答基因在第1天和第4天的T细胞、B细胞和NK细胞中富集，在第16天中消失，表明干扰素应答基因的表达是一种动态模式，且新冠肺炎重症患者对干扰素应答的反应比轻症患者更加强烈。接下来分析转录因子表达分析观察到COVID-19患者中，STAT1 [一种响应干扰素（Interferon，IFN）而激活的主要转录因子] 和IRF3在活化的CD4⁺T细胞，细胞毒性CD8⁺T细胞，幼稚T细胞和DC中上调；而转录因子STAT3、NFκB等在IAV患者中上调，且观察到患者血浆中IL-6的水平与疾病的严重程度相关。第二项基于DNBelab C系列平台的新冠肺炎研究，揭示新冠灭活疫苗接种后的免疫响应与机制。选取2组注射安慰剂和6组接种新冠疫苗的人群，在Day0、Day28、Day56各相隔28天接种3针，并在多个时间点收集血液进行单细胞测序分析。发现3种不同状态的CD16⁺单核细胞在接种疫苗之后均存在明显升高，尤其是CD16⁺IFN⁺单核细胞，其主要表达干扰素应答相关基因，说明接种疫苗后引起干扰素介导的抗病毒免疫反应的激活。进一步比较了第二针与第三针接种间隔只有一个月和大于9个月的免疫激活状态的差异，结果显示间隔时间更久时，抗原呈递细胞处于更活跃的状态。

► 研讨会点睛 

1. 流感和新冠病毒感染引起的免疫响应途径

2. 解析新冠疫苗接种后的免疫应答与免疫机制的方案设计

报告三

靶向GAS6-AXL信号轴抑制巨噬细胞NF-κB信号通路促进肝内胆管细胞癌干细胞对免疫治疗敏感

► 专家简介 

► 授课内容 

本次研讨会，陈德猛老师首先介绍了肝癌的临床背景和临床挑战：肝癌是全球第七大常见的癌症，而肝内胆管细胞癌是肝癌的第二大亚型，预后较差，五年生存率不到5%，迫切需要找到有效的治疗靶点。采用“水动力”方法向小鼠尾动脉注射转染质粒，构建小鼠肝内胆管细胞癌模型，切片染色等方法确认造模成功。首先分析上皮癌细胞，将其重新分为4个簇，RNA速率、分化程度和拟时序轨迹分析发现簇2可能是肿瘤进展起始的关键细胞。且簇2的Wnt通路存在明显激活，说明Wnt激活的上皮细胞亚型可能是肝内胆管细胞癌的起始细胞。接着构建肝细胞荧光标记小鼠，发现Wnt激活的肝内胆管细胞癌起源于正常肝细胞，突变积累后转分化为肝内胆管细胞，而非起源于肝内胆管细胞。进一步构建肝内特异表达Axin2⁺细胞消融小鼠模型，确定只用消除Wnt激活的基因Axin2就可阻碍肿瘤生长。然后肿瘤干细胞与肿瘤微环境的相互作用分析确定这两者之间的GAS6/AXL相互作用强度最大，推测可能通过该信号轴介导肿瘤逃逸；临床上也证实GAS6表达量高低与预后效果存在一定关联。从胆管细胞癌中流式分选出巨噬细胞，采取bulk RNA-Seq，发现与未经AXL抑制剂处理的组别相比，NF-κB信号通路受到显著激活，说明巨噬细胞通过NF-κB信号通路促进免疫抑制因子上调。以上多个结论都有通过构建基因激活或消融小鼠模型，或对转基因小鼠采用抑制剂或基因敲除处理后，观察肿瘤的发展变化，检测癌切片的增殖与凋亡信号得以证实。

► 研讨会点睛 

1. 构建小鼠肝内胆管细胞癌模型方法

2. 多种分析证实簇2可能是肿瘤进展起始的关键细胞

3. 肝内胆管细胞癌干细胞起源于正常肝细胞，而非肝内胆管细胞

4. 肝内胆管细胞癌通过GAS6/AXL信号轴与巨噬细胞互作

报告四

单细胞群体eQTL分析在疾病方向的应用

► 专家简介 

► 授课内容 

本次研讨会，刘博欣老师首先介绍了传统GWAS分析特点，它可实现高阶表型与DNA突变位点SNP（SingleNucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）的关联分析。eQTL分析则是将转录本的表达量作为中间表型，关联到DNA突变，鉴定影响转录本表达量变化的DNA突变位点SNP；结合单细胞测序技术，可实现单细胞群体eQTL分析，得以将基因表达分析从组织或样本层面，精细到细胞层面。接着刘博欣老师说明了单细胞群体eQTL分析解决的问题以及优势：由于个体数量多，各个细胞类型组分差异统计更具有说服力和可信度；可鉴定各个细胞类型共有或特异的eQTL。下一步通过具体案例讲解了单细胞群体eQTL分析的方案设计与思路^[13-14]。根据两篇文章思路总结了两种分析策略和方法。最后介绍了单细胞eQTL联盟组织，及其主要研究成果和分析方法^[18-20]。

► 研讨会点睛 

1. 单细胞群体eQTL分析的定义

2. 单细胞群体eQTL分析解决的问题

3. 单细胞群体eQTL分析策略一

4. 单细胞群体eQTL分析策略二

本次研讨会，殷建华老师基于已有研究介绍了疾病单细胞研究的方案设计和思路，并展望了未来的研究趋势；赵迎泽老师和陈德猛老师分别基于各自实验室的研究成果分享了单细胞测序在疾病中的具体应用——免疫响应和肿瘤发展机理；刘博欣老师细致讲解了单细胞群体eQTL的定义、可解决的问题，并根据具体案例梳理了单细胞群体eQTL的分析思路，最后整理了对应的两种分析策略。以上内容为疾病单细胞研究提供了诸多参考素材和方案。

同时，基于华大自主DNBelab C系列单细胞平台，华大科技现推出单细胞群体eQTL解决方案，与您一起走进单细胞规模化研究时代，为您的疾病单细胞研究添砖加瓦，助力开辟创新性的研究成果（点击链接）。

参考文献（下滑可查看）：

[1] Zhu L, Yang P, Zhao Y, et al. Single-Cell Sequencing of Peripheral Mononuclear Cells Reveals Distinct Immune Response Landscapes of COVID-19 and Influenza Patients. Immunity. 2020;53(3):685-696.e3. doi:10.1016/j.immuni.2020.07.009

[2] Ding R, Liu S, Wang S, et al. Single-cell transcriptome analysis of the heterogeneous effects of differential expression of tumor PD-L1 on responding TCR-T cells. Theranostics. 2021;11(10):4957-4974. Published 2021 Mar 5. doi:10.7150/thno.55075

[3] Wang W, Zhong Y, Zhuang Z, et al. Multiregion single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of the immune microenvironment of colorectal cancer. Clin Transl Med. 2021;11(1):e253. doi:10.1002/ctm2.253

[4] Stubbington MJT, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, Teichmann SA. Single-cell transcriptomics to explore the immune system in health and disease. Science. 2017;358(6359):58-63. doi:10.1126/science.aan6828

[5] Stewart, B.J., Ferdinand, J.R. & Clatworthy, M.R. Using single-cell technologies to map the human immune system — implications for nephrology. Nat Rev Nephrol. 16, 112–128 (2020). https://doi.org/10.1038/s41581-019-0227-3

[6] Nehar-Belaid D, Hong S, Marches R, et al. Mapping systemic lupus erythematosus heterogeneity at the single-cell level. Nat Immunol. 2020;21(9):1094-1106. doi:10.1038/s41590-020-0743-0

[7] Smillie CS, Biton M, Ordovas-Montanes J, et al. Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis. Cell. 2019;178(3):714-730.e22. doi:10.1016/j.cell.2019.06.029

[8] Xu Z, Chen D, Hu Y, et al. Anatomically distinct fibroblast subsets determine skin autoimmune patterns. Nature. 2022;601(7891):118-124. doi:10.1038/s41586-021-04221-8

[9] Jin X, Simmons SK, Guo A, et al. In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes. Science. 2020;370(6520):eaaz6063. doi:10.1126/science.aaz6063

[10] Liu B, Jing Z, Zhang X, et al. Large-scale multiplexed mosaic CRISPR perturbation in the whole organism. Cell. 2022;185(16):3008-3024.e16. doi:10.1016/j.cell.2022.06.039

[11] Yoshida M, Worlock KB, Huang N, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-327. doi:10.1038/s41586-021-04345-x

[12] Su Y, Yuan D, Chen DG, et al. Multiple early factors anticipate post-acute COVID-19 sequelae. Cell. 2022;185(5):881-895.e20. doi:10.1016/j.cell.2022.01.014

[13] Perez RK, Gordon MG, Subramaniam M, et al. Single-cell RNA-seq reveals cell type-specific molecular and genetic associations to lupus. Science. 2022;376(6589):eabf1970. doi:10.1126/science.abf1970

[14] Yazar S, Alquicira-Hernandez J, Wing K, et al. Single-cell eQTL mapping identifies cell type-specific genetic control of autoimmune disease. Science. 2022;376(6589):eabf3041. doi:10.1126/science.abf3041

[15] Nathan A, Asgari S, Ishigaki K, et al. Single-cell eQTL models reveal dynamic T cell state dependence of disease loci. Nature. 2022;606(7912):120-128. doi:10.1038/s41586-022-04713-1

[16] Mistry P, Barmania F, Mellet J, et al. SARS-CoV-2 Variants, Vaccines, and Host Immunity. Front Immunol. 2022;12:809244. Published 2022 Jan 3. doi:10.3389/fimmu.2021.809244

[17] Zhu L, Yang P, Zhao Y, et al. Single-Cell Sequencing of Peripheral Mononuclear Cells Reveals Distinct Immune Response Landscapes of COVID-19 and Influenza Patients. Immunity. 2020;53(3):685-696.e3. doi:10.1016/j.immuni.2020.07.009

[18]Van der Wijst MGP, Brugge H, de Vries DH, et al. Single-cell RNA sequencing identifies celltype-specific cis-eQTLs and co-expression QTLs. Nat Genet. 2018;50(4):493-497. doi:10.1038/s41588-018-0089-9

[19] Võsa U, Claringbould A, Westra HJ, et al. Large-scale cis- and trans-eQTL analyses identify thousands of genetic loci and polygenic scores that regulate blood gene expression. Nat Genet. 2021;53(9):1300-1310. doi:10.1038/s41588-021-00913-z

[20] Cuomo ASE, Alvari G, Azodi CB; single-cell eQTLGen consortium, McCarthy DJ, Bonder MJ. Optimizing expression quantitative trait locus mapping workflows for single-cell studies. Genome Biol. 2021;22(1):188. Published 2021 Jun 24. doi:10.1186/s13059-021-02407-x

*涉及未发表数据暂不展示

供稿：豆儿

编辑：市场部

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