Cell Reports | DNBelab C系列单细胞平台助力发现自闭症新机制

脑发育是一个严格复杂和精确调控的过程。在这个过程中，带有bHLH（basic-helix-loop-helix，基本螺旋-环-螺旋）结构的转录因子能够通过转录激活或抑制作用，调控多能神经干细胞向神经元和少突胶质细胞的命运决定。但是，bHLH 转录因子是否也调节神经干细胞向星形胶质细胞分化仍然未知。神经元PAS结构域蛋白3（NPAS3）属于α型bHLH-PAS（Per-Arnt-Sim）超家族成员，但其在早期皮层发育、神经干细胞分化和星形胶质细胞生成中的作用仍有待揭示。

2022年8月30日，华大自主单细胞DNBelab C系列平台助力中国科学院北京生科院孙中生团队于Cell Reports（影响因子9.995）发表题为“Npas3 deficiency impairs cortical astrogenesis and induces autistic-like behaviors”的文章，首次揭示了NPAS3调节星形胶质细胞分化从而参与自闭症的致病机理。

样本设计

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1个雄性WT野生型样本和1个雄性Npas3^−/−实验组样本，使用DNBelab C系列平台进行高通量scRNA-Seq，共得到约15,000个单细胞的转录组数据。

技术点睛

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1

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技术手段综合全面

该研究综合运用神经生物学（测量脑重量、大小、核磁共振成像、三腔社会互动分析、透射电子显微镜成像）、遗传学（基因敲除小鼠模型构建）、多组学（bulk RNA-Seq、scRNA-Seq、ChIP测序）、细胞生物学（神经元-星形胶质细胞共培养试验、免疫染色试验、高尔基染色）等技术，全面解析并论述NPAS3调节神经发育及参与自闭症的致病机理和途径。

2

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研究方案清晰完整

发现Npas3基因表达水平差异——分析Npas3缺陷小鼠表型及行为的变化——挖掘Npas3影响的信号通路和功能（bulk RNA-Seq）——鉴定Npas3缺陷影响的细胞类群及代谢途径（高通量scRNA-Seq）——解析Npas3缺陷对细胞分化轨迹的影响（拟时间分析）——构建星形胶质细胞Npas3敲除小鼠模型进行验证，研究思路清晰，结构相对完整。

研究成果与结论

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研究人员首先通过对已发表的小鼠的单细胞转录组数据进行分析，发现Npas3基因在星形胶质细胞的表达显著高于其他皮层细胞。接下来运用免疫染色试验检测Npas3缺陷小鼠皮层中的星形胶质细胞，发现该种细胞生成减少。此外Npas3缺陷小鼠还伴随着脑发育异常，脑重和脑宽显著增加。核磁共振成像显示，成年Npas3^+/−杂合小鼠脑脊液体积也明显增加。三腔社会互动分析中，Npas3缺陷会在小鼠中诱发类似自闭症的行为，如重复性刻板行为、社交能力受损和语言交流异常等。

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关键基因Npas3缺陷影响小鼠皮层突触密度和复杂性的变化

根据上述结果，研究人员推测Npas3可能调控星形胶质细胞分化，于是进一步研究了星形胶质细胞发生开始时NPAS3诱导的转录变化。研究人员收集WT和Npas3^+/−小鼠出生后0天（P0）的皮层细胞进行bulk RNA-Seq，发现Npas3^+/−小鼠皮层中有625个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。其中，表达下调的基因主要富集在调节胶质生成的途径中，包括PI3K和钙信号传导通路。特别的是，星形胶质细胞祖细胞Fabp7基因的水平显著降低（图1A和1B），这与FABP7的免疫荧光染色结果一致。此外，P0处下调的DEG还富集于突触调节功能，包括突触形成、组装以及神经递质水平和运输的调节（图1C）。其中，突触形成和功能的相互作用网络以Bdnf和Reln基因为中心（图1D）。与此一致，高尔基染色显示，Npas3^+/−中皮层基底树突中的II/III锥体神经元突触密度显著降低（图1E和1F）。通过透射电子显微镜鉴定突触后致密物（PSD）的存在，进一步证明非对称突触的数量在Npas3^+/−大脑皮层中显著减少（图1G和1H）。另外，WT皮层PSD长度分布在200 nm左右（图1J），而Npas3^+/−中的显著减少，分布在140 nm左右（图1I），表明Npas3^+/−大脑皮层的突触密度和复杂性降低。

接下来，为了探究Npas3^+/−皮层中异常的星形胶质细胞发生是否导致突触缺陷，研究人员进行了神经元-星形胶质细胞共培养试验。结果发现，与Npas3^+/−或Npas3^−/−星形胶质细胞共培养的神经元的突触密度相比，WT组的显著减少（图1K）。总而言之，以上情况表明Npas3缺陷皮层中星形胶质细胞的异常发生降低了突触的密度和复杂性。

图1 Npas3^+/−小鼠中突触密度和复杂性的变化

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Npas3^−/−小鼠皮层中的星形胶质细胞类群比例降低与转录变化

为了阐明Npas3^−/−皮层中的细胞类群变化，研究人员选用1个雄性WT野生型和1个雄性Npas3^−/−小鼠样本，基于华大自主DNBelab C系列平台进行高通量单细胞RNA测序，共得到约15,000个单细胞的转录组数据（图2A）。结果表明，Npas3^−/−皮层中星形胶质细胞比例降低；且中间神经元的比例降低，而兴奋性神经元的比例增加，表明Npas3^−/−皮层中兴奋-抑制平衡受损。为了检测Npas3缺失后受影响的主要细胞类型，研究人员接下来分析了WT和Npas3^−/−中每个细胞簇的相对基因表达水平的相关性。结果显示，星形胶质细胞的相关性是第二低的，这表明与其他细胞簇相比，它们在两组之间的基因表达差异较大（图2B）。在Npas3^−/−大脑皮层的星形胶质细胞中，共鉴定到81个下调基因，其功能富集在胶质生成、星形胶质细胞分化、突触形成和代谢过程（图2C），表明NPAS3在小鼠皮层的非神经元细胞中发挥着多样的作用。

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Npas3^−/−小鼠皮层中星形胶质细胞的异常分化

前文已经得知Npas3缺陷导致星形胶质细胞生成减少，研究人员接着深入分析了Npas3缺陷对星形胶质细胞发生时分化轨迹的影响。已有研究表明，放射状胶质细胞直接在皮层生成少突胶质细胞祖细胞（OPCs）、中间祖细胞和星形胶质细胞。于是研究人员选择这四种细胞类型，利用Monocle拟时间分析工具来推断分化轨迹。结果显示放射状胶质细胞处于分化轨迹的开始，然后几乎同时分化为中间祖细胞和OPCs，星形胶质细胞则在分化轨迹末端（图2D）。尽管这四种细胞类型在WT和Npas3^−/−皮层中具有相同的分化轨迹，但是它们的细胞密度在不同阶段中有所差异。比如星形胶质细胞，与WT组相比，在Npas3^−/−组中首先降低，然后增加，最后再降低（图2E）。

然后研究人员将上述轨迹分为四个阶段，解析分化过程中的转录变化（图2F）。星形胶质细胞主要分布在第4阶段，此时Npas3^−/−组表现为星形胶质细胞标志基因Aldhl1、Fgfr3和Gfap的下调（图2G），表明星形胶质细胞生成受损。此外，Npas3^−/−皮层中的突触生成评分和兴奋性氨基酸转运蛋白Slc1a3的表达降低（图2G），表明突触功能降低。4阶段细胞也参与代谢过程，因为此时Npas3^−/−组中Apoe的表达降低，提示星形胶质细胞相关代谢功能受损。这些结果共同表明，Npas3缺陷导致皮层细胞在不同阶段经历了异常分化。

图2 Npas3^−/−皮层中星形胶质细胞分化异常

接下来，研究人员对原代培养的星形胶质细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）测序分析，揭示出NPAS3的结合靶点覆盖了星形胶质细胞形成的各个过程，涉及大脑发育、树突发育和突触形成的调节网络。

最后，研究人员在野生型小鼠星形胶质细胞中特异性敲低NPAS3后，小鼠表现社交能力受损、声音交流异常等自闭症样相关行为。

科技君点睛

BGITech

该研究发现NPAS3是星形胶质细胞形成的关键调节因子。Npas3缺陷会导致皮层星形细胞生成减少，同时伴随着大脑发育异常和自闭症表现。高通量单细胞转录组结果显示，Npas3敲除引起从放射状胶质细胞到星形胶质细胞的分化异常。ChIP测序分析表明，NPAS3的结合靶点与大脑发育和突触形成的功能有关。共培养试验进一步表明，Npas3缺陷的星形胶质细胞生成诱导野生型神经元的突触缺陷。最后，特异性敲低野生型小鼠皮层中星形胶质细胞的Npas3后，小鼠表现出自闭症样相关的形态和行为异常。总之，该研究鉴定Npas3在星形胶质细胞分化中的调控网络和参与自闭症的致病机理，为理解神经发育障碍疾病的机理带来了全新视角。

原文链接（点击文末“阅读原文”即可查看）：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111289

供稿：豆儿

编辑：市场部

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