RNA质检结果，你真的看懂了么？
众所周知，DNA和RNA这两种生物大分子，是传递生命信息、决定生物性状的重要载体，对这两类核酸分子进行高通量测序则是“破解”生命密码的必经之路，而核酸分子的质量直接关系着测序结果的真实性和有效性。
在之前的分享中，科技君为大家分享了DNA质检的干货知识，那么，在高通量测序领域占有半壁江山的转录组学研究中，应该如何对RNA进行质量检测呢？什么样的RNA才是高质量样本呢？
科技君
在正式回答以上问题之前，科技君先带大家了解几个相关问题：
1
Total RNA由rRNA、mRNA、tRNA、miRNA、lncRNA等不同类型的RNA组成，其中占比最高是rRNA，占总RNA的80%以上，因此可以利用rRNA来反应整体RNA的质量。目前，针对rRNA自身特性所设计的检测方法，已经成为了评价total RNA质量的金标准；
2
28S/18S或23S/16S：其中的S为sedimentation coefficient，是评价生物大分子在离心场中沉降速度的指标，数值越大，分子越大。不同生物的rRNA拥有不同的分子构象，其沉降系数自然也各不相同，如真核生物的一般含有5S、5.8S、18S和28S四种rRNA，原核生物则含有5S、16S及23S三种rRNA。其中，28S/18S这一比值常被用于反应真核生物RNA质量，23S/16S则被应用在原核生物RNA的检测中；
3
RIN或RQN：即RNA Integrity Number或RNA Quality Number，是判定RNA完整性的重要指标，经常在RNA的质检报告中出现。其计算过程与28S/18S、23S/16S不同，不是利用某两个峰的比值对RNA质量进行判定，而是从胶图的整体出发，减少偏向性，其数值为1-10，数值越大表明RNA越完整，质量越高，可以用于直接反映了RNA质量的高低。
一、
RNA质检的方法
常见的质检方法有：琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100、Fragment Analyzer等，其中琼脂糖凝胶电泳是针对RNA的定性检测，主要用来快速判断RNA的蛋白质污染、降解以及片段情况；而Agilent 2100与Fragment Analyzer的原理基本相同，利用微流控芯片或毛细管电泳的方式通过激发出的荧光，实现对RNA的定性、定量检测。
1. 琼脂糖凝胶电泳示意图：
①胶孔位置：如果有亮带，说明有蛋白质污染，示意图中的1、2、3号样品均有轻微的蛋白质污染；
②RNA片段检测区域：5S偏暗，28S与18S峰明显，质量较好（该样品为真核生物，如为原核生物，则会出现16S、23S条带）；
M1、M2为marker，用于定性片段大小。
2. Agilent 2100示意图：
①样品名或样品编号；
②纵坐标（FU）：仪器收集到的样品荧光值；
③横坐标（nt）：各峰对应的片段大小；
④峰型显示区以及面积统计区；
⑤模拟的胶图以及片段情况；
⑥根据峰图计算出来的各种数值。
Fragment Analyzer检测图与Agilent 2100类似。
除了上面提到的常见RNA检测方法外，还有使用Nanodrop等紫外分光光度计对RNA进行定量的方法，但是这些方法容易受到蛋白质、盐离子等污染的影响，从而导致定量不准确。以苯酚污染为例，从下图可以看出，使用紫外分光光度计测量出的RNA浓度随着污染量的增加而线性增加，即使非常少的污染也会对定量结果产生很大影响。同时，RiboGreen这种使用高灵敏核酸荧光染料对核酸进行定量的结果也有一定程度的波动。其中表现最为稳定的为Agilent 2100芯片。
二、
不同降解情况下的RNA图谱
（以Agilent 2100为例）
1. 完整性好的RNA
——28S/18S为2，RIN为10，基线平坦
2. 中度降解的RNA
——28S开始降解，基线上抬，RIN为5.2
3. 严重降解的RNA
——18S与 28S完全降解，RIN为2.2
三、
不同物种的RNA图谱示例
1. 动物类RNA图谱
左图为正常的动物样本RNA图谱，右图的18S旁边有2个峰，此时需要考虑微生物的污染。
2. 植物类RNA图谱
18S两边的峰是叶绿体RNA的图谱，从叶到茎再到根，叶绿体RNA含量不一样。
叶片部位：
茎部位：
根部位：
3. 原核生物类RNA图谱
4. 昆虫、节肢动物、软体动物等低等生物类RNA图谱
虽然昆虫、节肢动物、软体动物等低等生物都是真核生物，但它们的28S rRNA的28Sα和28Sβ 2个亚基是以氢键连接，热变性使得28Sα和28Sβ之间的氢键发生断裂，释放出了大小相似的2个片段，它们与18S重叠形成单峰，因此出现了没有28S或28S较低的现象。
欢迎垂询
RNA质量直接影响着文库、测序质量以及最终的分析结果，而RNA质检可以帮助我们了解样本是否适合进一步的测序和分析。
这里要注意的是，RNA检测合格，有时也不能完全不代表mRNA完整性好，mRNA的情况也会受样本的异质性的影响。因此，我们在面对一份RNA质检报告时，要通过RNA的完整性、纯度、浓度以及研究目的等因素综合评估样品的情况。另外，如果检测到了污染，还可以采取相应的措施来提高样品的质量，如DNase I消化、柱子与磁珠纯化。
华大科技服务有着严谨且丰富的RNA提取和质检判断经验，如果您在RNA提取和质检过程有任何问题，欢迎咨询！
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参考文献：
[1] Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis and UV spectrometry.
[2] Winnebeck EC, Millar CD, Warman GR. Why does insect RNA look degraded? J Insect Sci. 2010;10:159. doi: 10.1673/031.010.14119. PubMed PMID: 21067419.
供稿：小橘
编辑：市场部
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