CRISPR全基因组脱靶检测有哪些应用场景？一文了解！
近10年来，CRISPR技术显著推动了基因治疗攻克血液病、肿瘤、遗传病等疾病的进程，已成为新时代科学研究领域的有力工具。然而，该技术仍存在不足之处：20bp的识别位点特异性有限，可能造成较高的脱靶效应。目前，CRISPR系统研究重点依然在于降低脱靶率，提高特异性和准确性。
近年来，脱靶的检测方法发展迅速、多种多样，也各有优劣势。华大科技基于DNBSEQ自主平台推出了CRISPR全基因组脱靶检测服务，可以对已有参考序列（Reference Sequence）物种的不同个体，采用WGS方法进行基因组测序，将编辑物种全基因组测序数据与参考基因组进行比对，全面检测基因编辑导致的单核苷酸突变（SNPs）以及插入缺失变异（InDels）之后，通过分析sgRNA同源区域上的特有变异，从而检测可能的脱靶位点。相较于其他检测手段，全基因组脱靶检测的优点在于无偏，全面，准确性，能有效挖掘所有因基因编辑导致的变异位点，从而指导sgRNA的设计，对临床应用以及作物基因编辑的安全性验证有重要意义。
近日，华大科技CRISPR全基因组脱靶检测产品发布之后，不少小伙伴会疑惑：如何利用结果数据进行研究？
本期，科技君将分享两篇文章带大家一起了解全基因组脱靶检测究竟检测的是什么，以及科研大牛是如何玩转高通量测序数据的。
# 应用场景1
人类细胞：CRISPR/Cas9介导的T细胞基因工程的安全性评估
文章：Genome-wide off-target analyses of CRISPR/Cas9-mediated T-cell receptor engineering in primary human T cells
► 研究概要
利用T细胞抵御癌细胞是目前免疫治疗策略的一大趋势。T细胞受体（T-cell receptor, TCR）基因工程能够重定向T细胞特异性，消除同种异体反应性，同时促进了过继性T细胞转移（adoptive T-cell transfer, ACT）疗法的发展。CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂使基因的敲除或敲入工程成为可能。而基于全基因组的脱靶基因检测是验证工程T细胞安全性的有效手段。
作者基于CRISPR/Cas9技术，利用核糖核蛋白递送法敲除TCR以评估基因工程T细胞的安全性。利用全基因组测序来分析CRISPR/Cas9介导的TCR位点双链断裂是否和原代T细胞的脱靶有关。
► 测序策略：33X
► 数据分析
gRNA依赖型脱靶位点预测：根据非特异性核酸酶诱导的T细胞脱靶事件来评估T细胞的安全性。Cas-OFFinder在gRNA和非靶DNA之间筛选出mismatch≤4的匹配位点，作为潜在脱靶位点。全基因组检测的变异位点中，有两个为预测的核酸酶诱导的低频突变位点，均未通过全基因组变异检测（GATK）过滤条件。将对照组的InDel和编辑样本的InDel进行比对，并未在两个编辑样本中检测到共有变异，故前期预测的潜在脱靶位点都未得到证实。
深度靶向测序：为了进一步评估全基因组测序发现的潜在低频脱靶事件，作者对相关的基因座进行PCR扩增并进行靶向深度测序。结果显示，与对照相比，原先预测的脱靶位点并无显著性的突变。
图1 编辑细胞全基因组脱靶检测
# 应用场景2
水稻：大规模测序+大数据+多重生物计算方法，检测核酸酶的特异性
文章：A large-scale whole-genome sequencing analysis reveals highly specific genome editing by both Cas9 and Cpf1 (Cas12a) nucleases in rice
► 研究概要
电子科技大学张勇实验室、扬州大学张韬实验室及马里兰大学YiPing Qi实验室，以水稻为模型，基于“全基因组测序+大数据”分析策略，针对CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1（Cas12a）介导的植物基因组编辑脱靶效应进行有效解读。研究者利用严格的数据筛选和分析方法验证了Cas9和Cpf1的特异性，且可以通过合理设计gRNA来避免脱靶效应。
► 测序策略：45X-105X
► 数据分析
本研究选择了多种类型的再生与实生非编辑水稻作为对照，以T0代和T1代的CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1水稻作为编辑材料，同时还设置了不同的T-DNA插入拷贝数、sgRNA单/双链等变量条件，极大丰富了实验材料和数据体量。
采用4种基因组变异位点分析软件严格筛选各测序样本SNV、InDel变异位点，结果表明，相对水稻再生对照材料，Cas9、Cpf1基因组编辑水稻材料的全基因组变异位点绝对数量未显示明显差异，且变异位点基因组分布特征也与对照材料一致，又对不同CRISPR-Cas表达载体t-DNA插入拷贝数目及单sgRNA、双sgRNA表达载体转化水稻T0代编辑材料进行比对分析，均未检测到特有变异，表明Cas9、Cpf1核酸酶的表达没有诱导水稻基因组产生新的变异。
多重生物计算方法，查询水稻基因组与测序样本sgRNA、crRNA具1-10bp错配的潜在脱靶位点，将其与对应水稻T0代编辑材料检出的SNV、InDel变异位点进行双向比对，以期查明水稻T0代编辑材料基因组变异位点的具体来源。分析结果表明，与sgRNA存在1-2bp错配位点的Cas9-J水稻T0代编辑材料中，在8个基因组错配位点处检出了明确的脱靶变异。这8个检出的变异位点均为InDel，且进一步明确了Cas9-J水稻T0代编辑材料中这8个InDel变异属于Cas9脱靶效应。在其余11个Cas9及3个Cpf1编辑材料中，因为对应sgRNA、crRNA设计时采用了严谨标准，最大限度减少了水稻基因组中1bp及以上的错配可能，与之对应，没有在水稻T0编辑材料中检出脱靶效应。
图2 T0水稻潜在脱靶位点预测
科技君点睛
BGI Tech
CRISPR-Cas9作为基因编辑的强有力工具，其伴随而行的脱靶风险也一直为人所关注。所幸的是，借助基因测序技术，我们可以全方位地监测基因水平的脱靶效应，从而在源头提高gRNA的安全性。
华大科技推出的CRISPR全基因组脱靶检测产品，能够提供核酸提取到生信分析全流程服务。从交付结果中，您可以在sgRNA同源区域中看到对照和编辑个体的所有SNP/InDel位点，从中筛选感兴趣的区域或者基因进行分析。具体分析报告点击了解：新品发布 | CRISPR全基因组脱靶检测重磅上线，助力基因编辑基础研究！除此之外，我们还可以针对您的特定需求提供个性化分析服务，欢迎咨询！
CRISPR全基因组脱靶检测产品优势↓
定位精确：兼具DNBSEQ平台测序的所有优势，可以在全基因组范围内对编辑位点和脱靶位点，进行精确的定位分析；
无偏向性：全面分析每一个变异位点；
设计简单：无细胞模型限制；
经验丰富：大人群、大队列项目经验丰富；
超高通量：测序仪全面升级，可满足超高通量需求；
一站式全流程服务：从样本到结果，提供切实可行的全流程服务；
专业团队：博士级别专业团队支持。
欲知更多详情，
请联系华大科技当地销售代表↓↓↓
热线电话：400-706-6615
邮箱：info@genomics.cn
供稿：欧叶
编辑：市场部
近期热文
了解更多产品服务及资讯，关注我们！